腎衰養(yǎng)真膠囊對胰島素誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞瘦素及C-EBPα表達(dá)的影響.pdf

1、背景： 營養(yǎng)不良是慢性腎衰竭(chronicrenalfailure，CRF)患者(包括透析和非透析)臨床常見的重要并發(fā)癥。國內(nèi)報(bào)道65％以上終末腎臟病人發(fā)生營養(yǎng)不良。營養(yǎng)不良可加重免疫功能低下、貧血等，甚至導(dǎo)致多臟器衰竭，其發(fā)生不僅影響CRF患者的預(yù)后，而且與其死亡率密切相關(guān)。CRF營養(yǎng)不良研究成為近年來國際國內(nèi)腎臟病領(lǐng)域研究的重點(diǎn)課題。瘦素(Leptin)是新近發(fā)現(xiàn)由肥胖基因(Obesegene，Obgene)編碼的激素樣蛋

2、白，其分子量為16KD，主要功能是降低食欲，增加能量消耗，導(dǎo)致體重減輕。研究表明，Leptin與CRF關(guān)系密切，許多CRF患者，包括腹透、血透、腎移植的終末期腎衰患者均合并高Leptin血癥。CRF時(shí)腎小球?yàn)V過率下降，腎臟清除能力下降是Leptin升高的主要原因。另外CRF患者代謝紊亂如高胰島血癥、炎癥、高膽固醇血癥等均可上調(diào)Leptin基因的表達(dá)，導(dǎo)致體內(nèi)Leptin升高。研究發(fā)現(xiàn)，CRF透析患者血Leptin與體脂含量之比與患者蛋白

3、質(zhì)攝入量呈顯著負(fù)相關(guān)，與血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白呈負(fù)相關(guān)，與蛋白分解率呈負(fù)相關(guān)，提示Leptin與營養(yǎng)不良關(guān)系密切。目前國內(nèi)許多學(xué)者亦發(fā)現(xiàn)Leptin與CRF營養(yǎng)不良關(guān)系密切，是導(dǎo)致CRF患者厭食和營養(yǎng)不良的重要因素，但缺乏深入的細(xì)胞分子機(jī)制研究。 Leptin由脂肪細(xì)胞合成后以內(nèi)分泌、自分泌或旁分泌的形式作用于分布在多個(gè)部位的OB-R，從而發(fā)揮一系列效應(yīng)。包括：抑制食欲、減少能量攝??；增加交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性，使大量貯存的能量轉(zhuǎn)變成

4、熱能釋放，產(chǎn)熱增加：加重胰島素抵抗，對胰島素的合成、分泌發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)等。CRF患者體內(nèi)存在的高瘦素血癥可引起患者食欲抑制，能量消耗增加，體重減輕，導(dǎo)致CRF患者營養(yǎng)不良。 由于CRF營養(yǎng)不良病因病機(jī)十分復(fù)雜，CRF營養(yǎng)不良臨床治療顯得十分棘手，不可能找到特異性的藥物。西醫(yī)方面，一是替代療法，如靜滴氨基酸、白蛋白、能量合劑、水溶性維生素，注射重組生長激素及IGF-1，氨基酸透析等處理，以上療效短暫有限且價(jià)格昂貴。二是口服藥物開同

5、(主要成分為復(fù)方a-酮酸片)，開同是一種必需氨基酸和酮酸的混合制劑，其本身不含氮，在蛋白合成過程中利用尿素，其療效亦有限且價(jià)格較貴。以上均不適合我國國情，難以得到普遍應(yīng)用，尋求一種經(jīng)濟(jì)有效的治療方法迫在眉睫。中醫(yī)藥能有效改善營養(yǎng)不良，且在藥效上各有側(cè)重，作用機(jī)理和途徑也有所不同，因此，積極尋求改善CRF營養(yǎng)不良的中藥具有重要意義。 目的： 觀察腎衰養(yǎng)真膠囊含藥血清對胰島素誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞瘦素及C/EBPa表達(dá)的影響，探討腎

6、衰養(yǎng)真膠囊改善CRF營養(yǎng)不良的機(jī)制。 方法： 1.藥物血清制備：通過給予大鼠分別灌服中藥腎衰養(yǎng)真膠囊、開同和生理鹽水制備腎衰養(yǎng)真膠囊含藥血清、陽性對照開同含藥血清和空白血清。 2.脂肪細(xì)胞培養(yǎng)分組：原代培養(yǎng)大鼠前脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，通過油紅O染色鑒定為脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞隨機(jī)分為5組：正常細(xì)胞組、胰島素刺激組、空白血清組、中藥血清組和開同血清組，每組6孔，以相應(yīng)的試劑及藥物血清干預(yù)48小時(shí)后，吸取上清

7、，并提取細(xì)胞總RNA。 3.放免法檢測細(xì)胞上清Leptin分泌水平。 4.RT-PCR法檢測脂肪細(xì)胞OBmRNA和C/EBPamRNA表達(dá)：Trizol法提取和純化脂肪細(xì)胞總RNA，以0.1％DEPC處理水50μl溶解后分裝，加RNAin保存于-80℃冰箱。設(shè)計(jì)OB、C/EBPa及內(nèi)參GAPDH引物序列，取總RNA5μl進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，42℃，60分鐘形成cDNA，94℃，5分鐘，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取擴(kuò)增產(chǎn)物

8、5μl，加上樣緩沖液1μl，在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為0.5xTBE電泳緩沖液，恒定電壓90v，80分鐘。于紫外燈下拍照，將膠片上反應(yīng)帶在凝膠成像分析系統(tǒng)中掃描、分析電泳帶的灰度。目的基因mRNA表達(dá)量=每例標(biāo)本目的基因凝膠圖像平均灰度值/同一標(biāo)本GAPDH凝膠圖像平均灰度值。 結(jié)果： 1.前脂肪細(xì)胞經(jīng)激素、IBMX、胰島素誘導(dǎo)后可分化為成熟脂肪細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)上由纖維狀梭形變成橢圓形圓形，胞質(zhì)中出現(xiàn)脂肪

9、滴，隨著分化程度的加深，脂肪滴逐漸變大，油紅O染色見胞漿內(nèi)脂滴呈橘紅色。 2.各組細(xì)胞瘦素分泌水平的變化：脂肪細(xì)胞經(jīng)胰島素處理48h后，胰島素刺激組細(xì)胞Leptin分泌量較正常細(xì)胞組顯著增高(P=0.001)。經(jīng)藥物血清干預(yù)后，中藥血清組細(xì)胞Leptin分泌量較胰島素刺激組顯著降低(P=0.027)，開同血清組與胰島素刺激組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.512)，中藥血清組細(xì)胞Leptin分泌量較開同血清組降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=

10、0.104)。 3.各組細(xì)胞OBmRNA的表達(dá)：各組間OBmRNA相對表達(dá)量比較具有顯著性差異(F=10.323，P<0.001)。胰島素刺激組細(xì)胞OBmRNA相對表達(dá)量較正常細(xì)胞組顯著增高(P<0.001)，中藥血清組與胰島素刺激組相比較，脂肪細(xì)胞中OBmRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(p=0.005)；開同血清組OBmRNA表達(dá)水平較胰島素刺激組降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.433)；中藥血清組與開同血清組比較OBmRNA表達(dá)顯著下

11、調(diào)(p=0.033)。 4.各組細(xì)胞C/EBPamRNA的表達(dá)：各組間C/EBPamRNA相對表達(dá)量比較具有顯著性差異(F=5.421，P=0.003)。胰島素刺激組細(xì)胞C/EBPamRNA相對表達(dá)量較正常細(xì)胞組顯著增高(P=0.001)，中藥血清組與胰島素刺激組相比較，脂肪細(xì)胞中C/EBPamRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P=0.002)；開同血清組C/EBPa表達(dá)水平較胰島素刺激組降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.260)。