BIOMED-2 PCR反應(yīng)體系在B-NHL分子病理診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、背景和目的：非霍奇金淋巴瘤(NHLs)在所有的淋巴造血系統(tǒng)惡性疾病中占50％。NHLs是淋巴增生惡性病變中的一組異質(zhì)性病變,其診斷和分類(lèi)都是很復(fù)雜的。NHLs來(lái)源于B細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)育不同發(fā)育階段的細(xì)胞的異常增生。大約90-95%的淋巴系統(tǒng)惡性疾病是B細(xì)胞來(lái)源。B細(xì)胞的發(fā)育主要發(fā)生在次級(jí)淋巴器官的淋巴濾泡。淋巴系統(tǒng)增生疾病一般是通過(guò)組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫組化和流式細(xì)胞免疫表型來(lái)診斷的。雖然大多數(shù)病例可以做出診斷,但是偶然也有反應(yīng)性增

2、生病變和淋巴瘤難以區(qū)分。在這些病例中,Ig/TCR分子克隆研究可能是有用的方法。長(zhǎng)期以來(lái),SB分析是分子克隆分析研究的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管SB分析的可靠性比較高,但它逐漸被PCR技術(shù)所取代,因?yàn)樗袔讉€(gè)固有的缺陷:SB分析是費(fèi)時(shí)的,有技術(shù)上的要求,需要10-20ug高質(zhì)量的DNA,只有5-10%的有限的敏感性。PCR技術(shù)的最主要的優(yōu)點(diǎn)是其快速,只需少量的DNA,并且可以使用較差質(zhì)量的DNA,相對(duì)高的敏感性(1-5%),對(duì)于一些類(lèi)型的重排,其敏感

3、性甚至小于1%。并且PCR技術(shù)可以使用小的活檢組織(例如:細(xì)針活組織檢查獲得的組織),可以使用福爾馬林固定,石蠟包埋組織樣本。而這些組織的DNA的質(zhì)量通常是很差的,部分DNA已經(jīng)降解成小的片段。而且,如果需要的話,歸檔的組織也可以用于PCR分析。在成熟的B-NHL中,PCR鑒定Ig和TCR基因重排是最重要的診斷工具。但是,PCR方案中引物設(shè)計(jì)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致的假陰性和假陽(yáng)性,阻止了其在先前的克隆研究中得到的數(shù)據(jù)的可比性。為了解決這個(gè)問(wèn)題,

4、制定一套可靠并且簡(jiǎn)易的用于可疑的淋巴增生疾病常規(guī)克隆診斷的PCR方案,歐洲7國(guó)47個(gè)機(jī)構(gòu)參與了BIOMED-2concertedAction,發(fā)展了一套用于淋巴增生疾病診斷的多重PCR方案,來(lái)檢測(cè)淋巴造血系統(tǒng)惡性病變中的Ig和TCR的克隆性重排和染色體轉(zhuǎn)位:t(11;14)和t(14;18)。共設(shè)計(jì)了107條引物,放在18個(gè)多重PCR管中:三管VH-JH,兩管DH-JH,兩管Igkappa(Igκ),一管Iglambda(Igλ),三管

5、TCRbeta(TCRβ),兩管TCRgamma(TCRγ),一管TCRdelta(TCRδ),三管BCL1-IGH和一管BCL2-IGH。新鮮/冰凍組織被認(rèn)為是最理想的用于PCR克隆分析的DNA樣本。但是,對(duì)于診斷實(shí)驗(yàn)室和一些研究機(jī)構(gòu),不可能總能得到新鮮/冰凍組織,而石蠟包埋組織組成了大部分的樣本來(lái)源。從石蠟中抽取的DNA的質(zhì)量通常是很差的,所以在BIOMED-2PCR方案在被廣泛的用于診斷實(shí)驗(yàn)室之前,需要對(duì)PCR方案做出調(diào)整。對(duì)于克

6、隆性重排陽(yáng)性的病例,通過(guò)TA克隆測(cè)序可以觀察其IgVH基因的突變情況,而檢測(cè)IgVH基因的突變狀況是追蹤腫瘤發(fā)展階段的一個(gè)有用的方法。我們研究的目的是應(yīng)用BIOMED-2PCR方案來(lái)檢測(cè)福爾馬林固定,石蠟包埋組織的B-NHL,并來(lái)檢測(cè)BIOMED-2PCR方案的有效性。通過(guò)克隆測(cè)序研究IgVH基因的突變情況。在淋巴瘤的隨訪過(guò)程中,通過(guò)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和序列的變化來(lái)監(jiān)測(cè)微小殘留病變和疾病的發(fā)展。
　　材料與方法：1材料(1)NHL標(biāo)

7、本:收集1997-2008年我校醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及省內(nèi)其它醫(yī)院的B-NHL標(biāo)本75例,全部標(biāo)本經(jīng)中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋、4～5μm連續(xù)切片,除常規(guī)HE染色外,采用LCA(2811,DAKO)、CD3(F7.2.38,DAKO)和CD20(L26,DAKO)免疫組化S-P法標(biāo)記淋巴細(xì)胞亞群,根據(jù)腫瘤的免疫表型,確定為B-NHL,按照2001年WHO關(guān)于淋巴組織腫瘤的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有病例進(jìn)行分類(lèi),kappalightchain(L1C1

8、,DAKO)和lambdalightchain(LAM03+HP6054,DAKO)標(biāo)記輕鏈。(2)對(duì)照組標(biāo)本:陰性對(duì)照:收集反應(yīng)性增生的扁桃體石蠟包埋的標(biāo)本1例。陽(yáng)性對(duì)照:Raji細(xì)胞系DNA和Jurkat細(xì)胞系DNA。2方法(1)經(jīng)典蛋白酶K-酚氯仿法抽提石蠟組織DNA。β-2微球蛋白鑒定抽提的DNA的質(zhì)量。(2)采用BIOMED-2PCR方案中的完全I(xiàn)GH基因重排,Igκ基因重排及TCRγ基因重排引物,檢測(cè)75例NHL標(biāo)本IG基因

9、及TCRγ基因克隆性重排,產(chǎn)物先經(jīng)2%瓊脂糖電泳初篩后,行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。(3)克隆測(cè)序分析。
　　結(jié)果：1.采用BIOMED-2PCR方案,75例B-NHL克隆性重排的檢測(cè)率為85.3%(64/75)。其中IgH的檢測(cè)率是78.7%(55/75),聯(lián)合使用Igκ輕鏈,檢測(cè)率是85.3%(64/75)。2.三例克隆陽(yáng)性的病例測(cè)序結(jié)果:兩例DLBCL一例用的VH3基因片段,一例用的是VH4基因片段,兩例都存在體細(xì)胞

10、超突變,但沒(méi)有克隆內(nèi)的突變;疑難病例中用的是VH3基因片段,兩次發(fā)病的測(cè)序結(jié)果在IgHV3-21*02基因片段是一樣的,因此二次發(fā)病有克隆相關(guān)性,是原病的復(fù)發(fā);第二次發(fā)病在IgHV3-30*03基因片段出現(xiàn)了一個(gè)新的克隆,疾病有新的進(jìn)展。
　　結(jié)論：1.對(duì)高度懷疑為淋巴瘤的標(biāo)本進(jìn)行克隆性重排檢測(cè)時(shí),同一樣本必須同時(shí)進(jìn)行IgH和TCR基因重排的檢測(cè),才能保證結(jié)果的完整性和真實(shí)性,兩者缺一不可。2.BIOMED-2的PCR方案適合于福