量子點(diǎn)作為熒光探針在PCR體系中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：
　　量子點(diǎn)由于其獨(dú)特的熒光性質(zhì)而受到很多重視。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)具有熒光量子產(chǎn)率高，熒光波長(zhǎng)可調(diào)，峰型窄而對(duì)稱(chēng)，抗漂白能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，量子點(diǎn)在生物組織和細(xì)胞成像、熒光分析中具有重要應(yīng)用。其中一個(gè)潛在的應(yīng)用就是在PCR中把量子點(diǎn)作為熒光探針來(lái)分析DNA的擴(kuò)增情況。之前已有研究報(bào)道過(guò)納米粒子對(duì)PCR中DNA擴(kuò)增的影響，例如納米金和巰基乙酸(MAA)修飾的量子點(diǎn)。這些研究指出在適當(dāng)?shù)臐舛认?，納米粒子的加

2、入可以增加PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)率。然而，納米粒子的濃度對(duì)這些結(jié)果有重要影響。在較高的濃度下(例如MAA-CdSe大于40 nM)，PCR的擴(kuò)增會(huì)被抑制，產(chǎn)率很低。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)PCR過(guò)程開(kāi)始需要95℃下5分鐘的熱變性，然后是95℃變性，60℃退火和72℃延伸的30-40個(gè)熱循環(huán)，最后是72℃的5-10分鐘的延伸階段。這樣高溫的反應(yīng)條件對(duì)量子點(diǎn)的穩(wěn)定性勢(shì)必會(huì)造成影響。然而上述這些報(bào)道卻沒(méi)有一個(gè)對(duì)納米粒子在PCR熱循環(huán)的耐受性做系統(tǒng)地研究

3、。最近有一項(xiàng)研究報(bào)道了采用辛胺修飾的聚丙烯酸(OPA)包裹的量子點(diǎn)連接DNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并得到了一對(duì)一的量子點(diǎn)標(biāo)記的長(zhǎng)片段DNA探針。然而在PCR后量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度卻有了明顯的損失（約30％），這可能是由于OPA的分子量較低，而不能更穩(wěn)定地包裹量子點(diǎn)的緣故。因此抑制PCR擴(kuò)增和熱循環(huán)的不穩(wěn)定限制了量子點(diǎn)作為熒光探針在PCR領(lǐng)域中的應(yīng)用。
　　在本研究中，我們探索了量子點(diǎn)在PCR和熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)中應(yīng)用的可行性。我們合

4、成了有機(jī)相CdSe/ZnS量子點(diǎn)，并采用高分子量的兩親性聚合物(OPBEM)來(lái)包裹有機(jī)相合成的CdSe/ZnS量子點(diǎn)，并且選擇甲氧基PEG(mPEG)來(lái)保護(hù)量子點(diǎn)的表面，以此來(lái)增加量子點(diǎn)在PCR熱循環(huán)中的耐受性。測(cè)試結(jié)果表明，這樣修飾的量子點(diǎn)能夠在PCR的各種組分中（尤其是Mg離子）耐受40個(gè)熱循環(huán)而幾乎不損失熒光強(qiáng)度。在量子點(diǎn)與PCR擴(kuò)增反應(yīng)的研究中我們發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)與Ex PCR的相容性好明顯好于PCR。在Ex PCR中增加Ex Taq

5、聚合酶的濃度可以明顯緩解量子點(diǎn)對(duì)DNA擴(kuò)增的抑制。在Real-Time PCR中這種量子點(diǎn)也能夠提供穩(wěn)定可測(cè)的熒光。這些探索性的工作為量子點(diǎn)將來(lái)在PCR中的應(yīng)用展示了良好的開(kāi)端。最后我們又測(cè)試了以量子點(diǎn)為熒光供體的分子信標(biāo)對(duì)目的DNA的檢測(cè)效果。這一應(yīng)用也同樣證明了量子點(diǎn)在PCR體系中作為熒光探針檢測(cè)DNA的可行性。隨著量子點(diǎn)的表面修飾技術(shù)、連接技術(shù)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展，量子點(diǎn)可以應(yīng)用在PCR領(lǐng)域中作為熒光探針進(jìn)行定量分析。

6、r>　　方法：
　　1.量子點(diǎn)的合成與表征
　　采用有機(jī)相量子點(diǎn)合成方法，成功合成了CdSe/ZnS量子點(diǎn)。紫外光譜，熒光光譜，透射電子顯微鏡，XPS能譜，XRD分析等手段對(duì)合成的量子點(diǎn)進(jìn)行表征。
　　2.量子點(diǎn)的表面修飾
　　采用小分子巰基羧酸MPA和辛胺修飾的高分子PBEM(OPBEM)分別修飾有機(jī)相CdSe/ZnS量子點(diǎn)的表面，成功制備水溶性量子點(diǎn)。采用紫外光譜，熒光光譜，透射電子顯微鏡，DLS分析等手段對(duì)

7、合成的水溶性量子點(diǎn)進(jìn)行表征。
　　3.量子點(diǎn)穩(wěn)定性測(cè)試
　　分別對(duì)MPA和OPBEM包裹制備的水溶性CdSe/ZnS量子點(diǎn)進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，包括電泳穩(wěn)定性試驗(yàn)和PCR熱循環(huán)穩(wěn)定性試驗(yàn)。
　　4.OPBEM包裹的量子點(diǎn)以及其表面連接物在PCR熱循環(huán)中的穩(wěn)定性測(cè)試
　　測(cè)試了PCR反應(yīng)體系(包括普通PCR，Ex PCR和Real-time PCR)各組分（包括PCR buffer，dNTP，聚合酶，DNA引物和模板）對(duì)

8、量子點(diǎn)在熱循環(huán)中的熒光穩(wěn)定性的影響。分別用Tris-base，NH2-mPEG1000和NH2-mPEG2000對(duì)量子點(diǎn)表面連接保護(hù)，考察這些量子點(diǎn)連接物在熱循環(huán)中的熒光穩(wěn)定性。
　　5.量子點(diǎn)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響測(cè)試
　　考察OPBEM包裹的量子點(diǎn)mPEG2000連接物的引入對(duì)PCR擴(kuò)增的影響情況。
　　6.量子點(diǎn)分子信標(biāo)的合成，表征以及對(duì)目的DNA的檢測(cè)
　　合成了量子點(diǎn)分子信標(biāo)(QDMB)，并對(duì)其進(jìn)行UV

9、光譜和電泳表征。用QDMB對(duì)目的DNA進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試其熒光反彈倍數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.量子點(diǎn)的合成與表征
　　有機(jī)相CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率為72.74％±10％，TEM照片顯示量子點(diǎn)尺寸不超過(guò)5nm。XPS分析證明了量子點(diǎn)中含有Zn，S，Cd，Se元素。
　　2.量子點(diǎn)的表面修飾
　　對(duì)有機(jī)相CdSe/ZnS量子點(diǎn)進(jìn)行表面修飾，MPA-CdSe/ZnS熒光量子產(chǎn)率為12.09％±10％，OP

10、BEM包裹的量子點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率為34.87％±10％。
　　3.不同表面修飾的量子點(diǎn)的穩(wěn)定性
　　電泳試驗(yàn)中高分子包裹的量子點(diǎn)不受電泳溶液環(huán)境影響，而MPA修飾的量子點(diǎn)會(huì)被淬滅。PCR熱循環(huán)試驗(yàn)中MPA修飾的量子點(diǎn)發(fā)生淬滅或沉淀，不能保持穩(wěn)定性。OPBEM包裹的量子點(diǎn)能夠更好耐受熱循環(huán)。
　　4.OPBEM包裹的量子點(diǎn)在PCR熱循環(huán)中的穩(wěn)定性
　　采用OPBEM包裹的CdSe/ZnS量子點(diǎn)QD590進(jìn)行PCR熱循

11、環(huán)穩(wěn)定性試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)這種量子點(diǎn)本身可以耐受40個(gè)熱循環(huán)，但是在與PCR組分一起時(shí)卻容易受到Mg離子的影響。考察了不同QD590連接物對(duì)Mg離子耐受的情況并發(fā)現(xiàn)QD590-mPEG2000效果最好，連接反應(yīng)的比例為mPEG2000∶QD590=1000∶1。
　　5.量子點(diǎn)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響
　　量子點(diǎn)的引入會(huì)抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)。這種抑制在Ex PCR體系中比在PCR體系中要減弱很多，增加Ex Taq聚合酶的濃度可以明顯緩解

12、這種抑制。在熒光定量PCR的測(cè)試中，QD590-mPEG2000有熱循環(huán)的穩(wěn)定，可測(cè)的熒光信號(hào)和較輕的擴(kuò)增抑制。
　　6.量子點(diǎn)分子信標(biāo)的檢測(cè)效率
　　對(duì)兩種量子點(diǎn)分子信標(biāo)QD540MBIBFQ和QD590MBCy5檢測(cè)互補(bǔ)目的DNA的效果進(jìn)行了測(cè)試。測(cè)試結(jié)果表明在加入相當(dāng)于QDMB摩爾數(shù)100倍的互補(bǔ)目的DNA時(shí)，QD540MBIBFQ的熒光強(qiáng)度反彈倍數(shù)為1.4倍，QD590 MBCy5為1.7倍。二者的FRET能量傳遞效

13、率En分別為28.57％和41.18％。
　　結(jié)論：
　　1.量子點(diǎn)的合成與表征
　　本章采用文獻(xiàn)中報(bào)道的有機(jī)相量子點(diǎn)合成方法，成功合成了CdSe/ZnS量子點(diǎn)。紫外光譜，熒光光譜，透射電子顯微鏡，XPS能譜，XRD分析等手段對(duì)所合成的量子點(diǎn)進(jìn)行了表征。
　　2.量子點(diǎn)的表面修飾
　　采用小分子巰基羧酸MPA和OPBEM分別修飾有機(jī)相CdSe/ZnS量子點(diǎn)的表面，成功制備水溶性量子點(diǎn)。采用紫外光譜，熒光光譜

14、，透射電子顯微鏡，DLS分析等手段對(duì)所合成的量子點(diǎn)進(jìn)行了表征。
　　3.不同表面修飾的量子點(diǎn)的穩(wěn)定性
　　電泳試驗(yàn)結(jié)果表明，高分子包裹的量子點(diǎn)比MPA修飾的量子點(diǎn)更能夠耐受環(huán)境中離子的影響(例如EDTA)。PCR熱循環(huán)試驗(yàn)表明，高分子OPBEM包裹的量子點(diǎn)比小分子MPA修飾的量子點(diǎn)受熱循環(huán)溫度變化的影響要小。不同熒光波長(zhǎng)的OPBEM包裹的量子點(diǎn)有不同的耐受性。
　　4.OPBEM包裹的量子點(diǎn)在PCR熱循環(huán)中的穩(wěn)定性

15、r>　　OPBEM包裹的CdSe/ZnS量子點(diǎn)QD590本身可以耐受40個(gè)熱循環(huán)。QD590-mPEG2000可以有效對(duì)抗Mg離子的沉淀作用，連接反應(yīng)的比例為mPEG2000∶QD590=1000∶1。
　　5.量子點(diǎn)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的影響
　　DNA擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)QD590-mPEG2000的穩(wěn)定性沒(méi)有影響。但是量子點(diǎn)的引入?yún)s抑制了擴(kuò)增反應(yīng)。這種抑制可能是由于納米粒子對(duì)PCR組分的非特異性吸附造成的。這種抑制在Ex PCR體系

16、中比在PCR體系中要減弱很多。增加Ex Taq聚合酶的濃度可以明顯緩解這種抑制。在熒光定量PCR的測(cè)試中，QD590-mPEG2000有很好的表現(xiàn):熱循環(huán)的穩(wěn)定，可測(cè)的熒光信號(hào)和較輕的擴(kuò)增抑制。這為QD590-mPEG2000在熒光定量PCR的應(yīng)用提供了很好的前景。
　　6.量子點(diǎn)分子信標(biāo)的合成與檢測(cè)效率
　　成功合成并表征了兩種量子點(diǎn)分子信標(biāo)QD540MBIBFQ和QD590MBCy5，對(duì)其檢測(cè)互補(bǔ)目的DNA的效果進(jìn)行了測(cè)