Nogo-A、NgR及RhoA在未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細胞系的表達和缺氧缺糖后的表達及意義.pdf

1、全文分為三部分： 第一部分：未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細胞系的分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：獲取高純度的少突膠質(zhì)前體細胞系，并作鑒定，為進一步研究作細胞準備。 方法：出生2日齡的SD大鼠，無菌條件下斷頭取腦，剔除腦膜及血管。根據(jù)星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)前體細胞系生長的時間差異，細胞的粘附特性不同，利用振蕩分離純化法獲得純化的大鼠少突膠質(zhì)前體細胞，再用添加了N2、PDGF、bFGF的無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。分別用少突膠質(zhì)前體細胞

2、系不同發(fā)育階段的特異性抗體：A285、04、01，采用免疫熒光法對表面抗原進行細胞鑒定。 結(jié)果：獲得純度95％以上的未成熟SD大鼠少突膠質(zhì)前體細胞，少突膠質(zhì)祖細胞A285、04抗體陽性；未成熟少突膠質(zhì)細胞04、01陽性。 結(jié)論：通過振蕩分離純化法及結(jié)合少突膠質(zhì)細胞定向培養(yǎng)基是培養(yǎng)少突膠質(zhì)前體細胞的可靠方法；N2、PDGF、bFGF的添加可以顯著提高細胞的產(chǎn)量，并使細胞保持在未成熟階段。 第二部分 ：未成熟大鼠少突

3、膠質(zhì)前體細胞系缺氧缺糖損傷后的變化 目的：建立未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體系細胞缺氧缺糖損傷模型，并觀察缺氧不同時間點細胞的變化。 方法：體外分離純化培養(yǎng)未成熟SD大鼠少突膠質(zhì)前體細胞系(OLPs)并鑒定(同第一部分)。缺氧缺糖模型組(oxygen & glucosedeprivation，OGD)選擇A285或04或01表面抗體標記陽性的細胞(即晚期OL前體和未成熟OL，OLPs)，使用耗氧劑連二亞硫酸鈉(Na<,2>S<,

4、2>O<,4>)及無糖Earle’s液制造OGD環(huán)境，細胞分別在此環(huán)境下培養(yǎng)10min、30min、60min及90min，并設立成熟OL OGD對照組和OLPs正常(無OGD)對照組。觀察各組細胞在不同時間點光鏡、電鏡下形態(tài)的改變；MTT法檢測不同時間點各組細胞存活率；DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察各組少突膠質(zhì)細胞凋亡百分率。 結(jié)果：(1)加入Na<,2>S<,2>O<,4>濃度為10mmol/L時，無糖培養(yǎng)基中氧分壓在90m

5、in內(nèi)保持無氧或低氧，故選擇該濃度為制作OGD模型的適當濃度。(2)光鏡下，模型組OGD10min出現(xiàn)胞體水腫；30min即出現(xiàn)了明顯的細胞死亡和凋亡，胞體水腫，胞膜破裂，軸突腫脹，斷裂；正常對照組和成熟OL組細胞形態(tài)變化不明顯。(3)MTT結(jié)果顯示模型組OGD30min，細胞存活率降至75％；OGD90min，細胞存活率降至約50％。明顯低于正常對照組和成熟OL組(P均<0.05)。(4)DAPI染色顯示，模型組OGD10min即出現(xiàn)

6、細胞凋亡，隨著OGD時間的延長，凋亡細胞百分率逐漸增加，OGD60min，凋亡細胞百分率接近50％，模型組細胞凋亡百分率明顯高于正常對照組和成熟OL組(P均<0.05)。 結(jié)論：OGD導致OLPs形態(tài)學損傷，細胞存活率下降及凋亡率增加，同時表明OLPsOGD模型(OGD模型)建立成功，證實了OLPs對缺氧損傷的成熟依賴性。 第三部分：Nogo-A、NGR及RHOA在未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細胞及其缺氧缺糖模型中的表達及意義

7、 目的：觀察Nogo-A、NgR及RhoA在未成熟大鼠少突膠質(zhì)前體細胞系(OLPs)的表達和細胞定位，以及缺氧缺糖損傷后的表達，探討它們在OLPs系損傷后再生抑制中的作用。 方法：采用改良振蕩分離純化法體外培養(yǎng)OLPs(同第一部分)；用含連二亞硫酸鈉的無糖培養(yǎng)基模擬造成OLPsOGD模型(同第二部分)。用OLPs特異性抗體A285、04、01和MBP進行免疫熒光法作細胞鑒定。然后在相應的OLPs分化階段和分別在OOD不同

8、時段：10min、30min、60min用免疫熒光法和免疫印跡法觀察Nogo-A、NgR及RhoA的表達。 結(jié)果：Nogo-A、NgR、RhoA在OLPs分離純化培養(yǎng)后的第1、2和4天均有陽性表達，且隨細胞成熟度增加而表達增強，Nogo-A、NgR的陽性信號位于胞體及突起；RhoA的陽性信號位于胞漿及突起。Nogo-A在OLPs缺氧缺糖10min表達較正常對照組增強，30min繼續(xù)增高，60min最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.

9、05)； NgR在OLPs缺氧缺糖后10min，表達較正常對照明顯增強，30min達最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，60min降低，與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)：RboA在OGD后10min，表達較正常顯著增強，且迅速達最高峰，OGD后30min，RhoA表達逐漸減弱， 60min繼續(xù)下降，但RhoA表達均正常對照組顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0．05)。 結(jié)論：在OLPs胞體及突起上均表達N