EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist1在肝癌血管生成擬太形成中差異microRNA的篩選.pdf

1、背景與目的:
　　 miRNA(microRNA)是一些長度很短的非編碼RNA，通過降低靶基因的穩(wěn)定性或抑制其翻譯水平來影響細胞的分化、增殖和凋亡。最近有研究表明miRNA對于腫瘤形成起到重要作用。關(guān)于其在VM發(fā)生發(fā)展中所起的作用，已經(jīng)日益成為研究的熱點，本課題采用博奧公司miRNA基因芯片檢測肝細胞肝癌HepG2過表達Twist1后差異表達的miRNA基因，并采用實時定量PCR驗證芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性;通過生物信息學(xué)分析差異miR

2、NA的作用靶點，篩選出VM相關(guān)miRNA，并探討其在VM形成中發(fā)揮作用的可能機制。該研究結(jié)果為探明miRNA在Twist1調(diào)控EMT進而促進VM形成過程中發(fā)揮其調(diào)控作用的具體機制提供理論指導(dǎo)和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 本研究將人肝癌細胞株HepG2作為細胞研究對象，通過構(gòu)建Twist1表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染HepG2細胞獲得過表達Twist1的肝癌細胞模型，以未轉(zhuǎn)染的HepG2細胞作為對照，分別提取RNA，在此基礎(chǔ)上利用博

3、奧公司的miRNA芯片對其進行實驗分析過表達Twist1可引發(fā)的miRNA表達譜變化，建立miRNA基因表達譜，找出明顯上調(diào)或下調(diào)的基因進行分析。
　　 從中選取表達差異最明顯的上調(diào)的hsa-miR-128及下調(diào)的has-miR-27a、has-miR-26b、has-miR-17，采用實時定量PCR技術(shù)進一步驗證芯片的結(jié)果，并用U6作為內(nèi)參。芯片檢測結(jié)果數(shù)據(jù)由上海其明公司結(jié)合生物信息學(xué)方法利用TargetScan數(shù)據(jù)庫查詢mi

4、RNA的靶基因，通過篩選已報道與VM相關(guān)的靶基因找出可能在VM形成過程中具有調(diào)控作用的miRNA。
　　 結(jié)果:
　　 1.在HepG2細胞過表達Twist1的肝癌細胞模型中查出差異表達有統(tǒng)計學(xué)意義的18個miRNA:其中上調(diào)的miRNA基因5個:has-miR-128、has-miR-132、has-miR-151-5p、has-miR-26a、has-miR-3195;下調(diào)的miRNA基因13個:has-miR-25

5、、has-miR-1246、has-miR-19a、has-miR-378、has-miR-486-3p、has-miR-140-3p、has-miR-26b、has-miR-27a、has-miR-19b、has-miR-1260b、has-miR-23b、has-miR-17、has-miR-9。
　　 2.miRNA的實時定量PCR驗證結(jié)果顯示:has-miR-27a、has-miR-26b、has-miR-17在 Hep

6、G2-Twist1細胞中相對低表達，而has-miR-128在HepG2-Twist1細胞中相對高表達，與芯片結(jié)果基本吻合。
　　 3.生物信息學(xué)預(yù)測到的靶基因情況:miRNA靶基因個數(shù)不盡相同，有數(shù)百種甚至上千種;在眾多靶基因中篩選出與VM相關(guān)的VE-cadherin、EphA2、MMP2和VEGF-A等靶基因以及對應(yīng)的miRNA（has-miR-27a、has-miR-26b和has-miR-17）。
　　 結(jié)論:<

7、br>　　 1.HepG2細胞過表達Twist1后有18種miRNA發(fā)生明顯的表達變化，其中包括5種上調(diào)表達:has-miR-128、has-miR-132、has-miR-151-5p、has-miR-26a、has-miR-3195;和13種下調(diào)表達:has-miR-25、has-miR-1246、has-miR-19a、has-miR-378、has-miR-486-3p、has-miR-140-3p、has-miR-26b、h

8、as-miR-27a、has-miR-19b、has-miR-1260b、has-miR-23b、has-miR-17、has-miR-9。
　　 2.has-miR-27a、has-miR-26b和has-miR-17可能在VM形成過程中通過改變VE-cadherin、EphA2、MMP2和VEGF-A等轉(zhuǎn)錄因子的表達發(fā)揮潛在的抑制VM形成的作用。
　　 3.Twist1促使腫瘤細胞發(fā)生EMT后，腫瘤細胞has-miR