組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的影響和機(jī)制研究.pdf

1、21世紀(jì)是器官移植、微創(chuàng)手術(shù)、基因治療的時(shí)代，作為“醫(yī)學(xué)之巔”的器官移植已經(jīng)成為治療終末期病變和器官功能衰竭的一種最有效的方法。隨著外科技術(shù)的改進(jìn)，免疫抑制劑的發(fā)展，我國的肝移植已取得了很大的進(jìn)步，術(shù)后1年存活率已達(dá)到90％以上，接近或達(dá)到國際先進(jìn)水平。在供肝日益短缺的大背景下，供肝匱乏已成為制約肝移植進(jìn)一步發(fā)展的世界性難題，在我國，供、受者之比高達(dá)150:1。衛(wèi)生部大力推行的心死亡器官捐獻(xiàn)(donation after cardiac

2、 death,DCD)，是我國現(xiàn)階段解決器官來源的科學(xué)決策。
　　但與腦死亡和活體肝移植相比，DCD移植遠(yuǎn)期預(yù)后效果差，并發(fā)癥發(fā)生率高。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為影響DCD肝移植效果的主要原因在于熱缺血時(shí)間延長導(dǎo)致的嚴(yán)重再灌注損傷，隨著我國DCD器官移植廣泛的開展，如何進(jìn)一步降低缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷，提高DCD移植效果將具有極其重要臨床意義。
　　目前I/R損傷的機(jī)制還不甚明了，但對(duì)其本質(zhì)

3、實(shí)為急性炎癥反應(yīng)已達(dá)成共識(shí)，而肝臟內(nèi)固有巨噬細(xì)胞即枯否細(xì)胞（Kup ffer cell，KC）是導(dǎo)致急性期炎癥反應(yīng)的“罪魁禍?zhǔn)住?。KC在肝臟I/R損傷中的作用還存在諸多爭議，尤其在肝移植伴有內(nèi)毒素血癥這種復(fù)雜的I/R中的作用尤其值得重視。
　　外周血的巨噬細(xì)胞進(jìn)入組織后，受局部微環(huán)境的影響，表現(xiàn)出不同的免疫應(yīng)答，獲得不同的功能表型即極化，發(fā)揮促炎或抗炎兩種截然相反的作用。KC在肝臟I/R損傷中是否也存在極化狀態(tài)？而這種極化是不是導(dǎo)

4、致其功能差異的原因所在？以及調(diào)控KC表型是否可以減輕肝臟損傷？這些都是值得探索的問題，將有利于從多方面，多角度深入探討KC表型和肝臟I/R損傷關(guān)系，明確關(guān)鍵性作用機(jī)制及具體環(huán)節(jié)，為臨床肝切除和肝移植過程中I/R損傷的防治以及臨床藥物研發(fā)打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
　　巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制尚未完全闡明。近年來，基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和表觀遺傳學(xué)的研究極大促進(jìn)了對(duì)其調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，相關(guān)研究方興未艾，基本上已涉及到所有的

5、病理生理過程，其中一個(gè)重要的部分就是組蛋白乙?；揎?更為可喜的是，表觀遺傳藥物包括組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑丁酸鈉、TSA、SAHA等已作為抗癌藥物，通過逆轉(zhuǎn)表觀遺傳性狀，正進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段;而在動(dòng)物研究中，HDAC抑制劑的使用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其“適應(yīng)癥”，發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。本文也探討了丁酸鈉，主要來自大腸中厭氧桿菌對(duì)碳水化合物和纖維素的酵解，對(duì)肝臟I/R損傷的影響，以期為臨床新藥的

6、研發(fā)提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　第一部分 丁酸鈉對(duì)Kupffer細(xì)胞表型的影響及在部分肝臟缺血再灌注損傷中的作用
　　目的:探討KC在部分肝臟I/R損傷中表型演變規(guī)律，HDAC抑制劑丁酸鈉對(duì)其影響及在I/R損傷中的作用。
　　方法:SD雄鼠隨機(jī)分為四組(n=8-10):假手術(shù)組(Sham)、模型組(Vehicle)、丁酸鈉小劑量組(Butyrate100mg/Kg)和大劑量組(Butyrate300mg/Kg)。各組

7、于缺血前30分鐘分別經(jīng)陰莖背靜脈注射相應(yīng)劑量的生理鹽水或丁酸鈉，建立70％部分肝I/R模型，再灌注后3h、6h、12h或24h后采血、取樣，分別檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平、肝組織髓過氧化物酶(myeloperoxtidase，MPO)活性、病理組織學(xué)改變，并采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-t

8、imequantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa)檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)表達(dá)，同時(shí)測定肝臟M1型標(biāo)志物:誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（induced nitric oxide s

9、ynthase，iNOS）、CD16、白介素-12(interleukin-12，IL-12)，M2型標(biāo)志物:精氨酸酶Ⅰ（arginaseⅠ，Arg1）、CD206、白介素-10(interleukin-10，IL-10)的表達(dá)。體外觀察Raw264.7細(xì)胞經(jīng)丁酸鈉預(yù)處理，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激后M1、M2型標(biāo)志物的表達(dá)。免疫組化檢測肝臟iNOS、Arg1及Cleaved Caspase-3、增殖細(xì)

10、胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表達(dá)。
　　結(jié)果:再灌注后，模型組ALT、AST明顯升高，肝臟壞死嚴(yán)重，中性粒細(xì)胞浸潤明顯。炎癥因子水平、MPO活性及M1型相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)升高。丁酸鈉干預(yù)后，尤其是大劑量，能夠明顯改善肝臟損傷，降低炎癥因子水平，誘導(dǎo)M2型相關(guān)分子表達(dá);并降低肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。體外丁酸鈉可誘導(dǎo)LPS刺激的Raw264.7細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變。

11、
　　結(jié)論:丁酸鈉干預(yù)能能夠減輕大鼠肝臟I/R引起的炎癥因子升高和中性粒細(xì)胞浸潤，有效改善肝功能損害和促進(jìn)修復(fù)，可能和誘導(dǎo)KC從M1型向M2型轉(zhuǎn)變有關(guān)。
　　第二部分 全肝和部分肝臟缺血再灌注損傷模型中Kupffer細(xì)胞表型的差異
　　目的:全肝和部分肝臟I/R損傷模型中KC表型的差異。
　　方法:SD雄鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組(Sham)、全肝I/R損傷組(Total I/R)、部分肝臟I/R損傷組(Parti

12、al I/R)，再灌注6h、24h后采血、取樣，分別檢測肝臟ALT、AST水平，病理組織學(xué)改變，并采用RT-PCR、Elisa檢測TNF-α、IL-6表達(dá)，同時(shí)檢測肝臟M1型標(biāo)志物(iNOS、CD16、IL-12)、M2型標(biāo)志物(Arg1、CD206、IL-10) mRNA表達(dá)。各組分別Elisa檢測檢測門靜脈內(nèi)毒素水平。
　　結(jié)果:再灌注后，兩模型組ALT、AST明顯升高，炎癥因子水平升高，肝臟壞死嚴(yán)重。全肝I/R損傷組傾向表達(dá)

13、M2型標(biāo)志物，部分肝臟I/R損傷組傾向于表達(dá)M1型標(biāo)志物。全肝I/R損傷組內(nèi)毒素水平升高。
　　結(jié)論:全肝和部分肝臟I/R損傷模型中存在KC表型差異，可能和內(nèi)毒素水平有關(guān)。
　　第三部分 丁酸鈉對(duì)全肝缺血再灌注損傷的影響
　　目的:探討丁酸鈉對(duì)全肝I/R損傷的影響。
　　方法:SD雄鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(Sham)、模型組(Vehicle)、丁酸鈉組(Butyrate)。各組于缺血前30分鐘分別經(jīng)陰莖背靜脈注

14、射相應(yīng)劑量的生理鹽水或丁酸鈉，建立全肝I/R模型，再灌注6h、24h后采血、取樣，分別檢測ALT、AST水平;肝組織MPO活性;肝臟及小腸病理組織學(xué)改變，并采用RT-PCR、Elisa檢測TNF-α、IL-6表達(dá)，并測定門脈內(nèi)毒素含量變化。掃描電鏡及透射電鏡觀察小腸粘膜顯微變化。免疫組化及Western blot檢測小腸緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)。
　　結(jié)果:再灌注后模型組ALT、AST明顯升高，肝臟壞死嚴(yán)重，中性粒細(xì)胞浸潤，伴小