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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:探討先天性心臟病中CITED2基因突變的致病機(jī)制即對(duì)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達(dá)的影響,同時(shí)檢測(cè)先天性心臟病患兒CITED2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化情況,并進(jìn)一步研究CITED2基因的轉(zhuǎn)錄水平的改變,探討其與先天性心臟病的發(fā)生的相關(guān)性。
方法:將成功構(gòu)建的CITED2(c.573-578de16)突變重組質(zhì)粒及CITED2野生型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到HepG2及H9C2細(xì)胞中,置于低氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24小時(shí),分別提取RNA,檢
2、測(cè)HIF-1α的mRNA的表達(dá)差異。同時(shí)48小時(shí)后提取蛋白,檢測(cè)HIF-1α蛋白的表達(dá)差異。收集31例先天性心臟病患兒及2例意外死亡兒童的右心耳組織,分別提取組織基因組DNA,采用亞硫酸氫鹽修飾試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽的修飾后并保存。利用生物信息學(xué)軟件分析篩選其中兩段,分別采用亞硫酸氫鹽修飾結(jié)合測(cè)序法(BSP法)及甲基化特異性PCR法(MSP法)進(jìn)行甲基化的檢測(cè)。提取甲基化組及未甲基化組RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光
3、定量PCR法檢測(cè)兩組CITED2基因mRNA水平的表達(dá)差異。
結(jié)果:
1.HepG2及H9C2細(xì)胞中均存在,HIF-1α的mRNA的表達(dá):野生組與空載體組相比,表達(dá)量明顯降低(P<0.05);突變組表達(dá)量高于野生組(P<0.05);而空載體組與未轉(zhuǎn)染組相比,未見明顯差異。
2.HepG2及H9C2細(xì)胞中均存在,HIF-1α蛋白的表達(dá):野生組與空載體組相比,表達(dá)量明顯降低(P<0.05);突變組均高于野生組,
4、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空載體組與未轉(zhuǎn)染組相比,未見明顯差異。
3.采用BSP法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在克隆測(cè)序成功的12例先天性心臟病心肌組織中,有10例發(fā)現(xiàn)存在甲基化,甲基化陽性率為83%(10/12)。
4.采用MSP法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn):在19例先天性心臟病心肌組織中發(fā)現(xiàn)16例存在甲基化,甲基化陽性率為84%(16/19)。
5.對(duì)照組甲基化檢測(cè)陽性率均為0%。
6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)
5、果顯示甲基化組與對(duì)照組相比CITED2基因mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
1.CITED2能反饋的抑制HIF-1α的表達(dá)。
2.CITED2突變后使得CITED2對(duì)HIF-1α的負(fù)反饋抑制作用減弱。
3.CITED2基因突變引起的HIF-1α的過表達(dá)可能是促進(jìn)先天性心臟病的發(fā)生的因素之一。
4.先天性心臟病中存在CITED2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的異常甲基化的改變,
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