P-選擇素不同功能域克隆、單抗制備及其功能的初步研究.pdf

1、P-選擇素（P-selectin）是細(xì)胞粘附分子選擇素家族的主要成分,是急性炎癥早期介導(dǎo)炎癥細(xì)胞向受損部位趨集過程中的重要因素.進(jìn)一步闡明P-selectin結(jié)構(gòu)與功能及其在腎臟疾病等病理機(jī)制中的作用,并為針對其的臨床特異性抗粘附治療奠定基礎(chǔ).為此我們設(shè)計(jì)并進(jìn)行了以下的研究.利用PT-PCR技術(shù),該研究首先從人外周血血小板中克隆出P-selectincDNA,并擴(kuò)增和獲得了其中Lectin片段及Lectin-EGF片段,然后將目的基因分

2、別插入含有Kan的質(zhì)粒pET42b（+）中和含有Amp的質(zhì)粒pcDNA4/HisMaxA中.再將含有目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α中進(jìn)行大量擴(kuò)增并鑒定.經(jīng)測序發(fā)現(xiàn),所獲目的基因序列與相關(guān)文獻(xiàn)和GeneBank（登錄號M25322）序列完全一致.將含有目的基因的重組質(zhì)粒分別在真核表達(dá)系統(tǒng)CHO和原核表達(dá)系統(tǒng)BL21中進(jìn)行表達(dá),利用限制性酶切、測序以及蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)目的基因均能表達(dá).但在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平偏低.選擇了原核表達(dá)系統(tǒng)B

3、L21.將一定量表達(dá)的目的蛋白通過Ni-NTA柱進(jìn)行純化,得到mg級純化的蛋白,通過SDS-PAGE電泳、ELISA、WesternBlot方法證明所獲蛋白即為目的蛋白.利用雜交瘤技術(shù)先行制備了抗人P-selectinLectin-EGF單克隆抗體.并通過ELISA方法,證實(shí)所獲單克隆抗體能與P-selectin抗原、及其Lectin、Lectin-EGF片段特異性反應(yīng);通過間接細(xì)胞免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀檢測.兩個(gè)試驗(yàn)均證實(shí)了該研究所