抗AT1受體自身抗體對人體胎盤血管的收縮作用.pdf

1、研究背景：先兆子癇是孕期特發(fā)疾病，由胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞入侵障礙、螺旋動脈重鑄障礙、胎盤血管異常收縮等引起的胎盤灌流量下降是其公認(rèn)的病理學(xué)基礎(chǔ)。但引起這一系列胎盤血管病變的原因尚不清楚。近年的研究表明，血管緊張素Ⅱ1型受體細(xì)胞外第二環(huán)自身抗體(AngiotensinⅡ1 Receptor Autoantibodies，AT1-AA)可能是先兆子癇的潛在危險因子，其血清濃度的高低與胎盤血流量成負(fù)相關(guān)，但二者之間是否具有因果關(guān)系尚缺乏直接證據(jù)。我們

2、的前期研究發(fā)現(xiàn)：AT1-AA可通過與AT1受體(AT1R)結(jié)合而引發(fā)大鼠胸主動脈血管的收縮反應(yīng)。其他學(xué)者以往的研究證實：人體胎盤絨毛膜上存在豐富的AT1R，但是在胎盤血管上是否有AT1R的分布并不十分清楚。如果有，血清中的AT1-AA是否能與胎盤血管上的AT1R結(jié)合，從而引起人體胎盤血管的收縮?如果能夠證實這一假說，將提供AT1-AA影響胎盤血流量的直接證據(jù)。由于可從臨床病人血清獲得AT1-AA的量極有限，不易滿足對AT1-AA功能效應(yīng)

3、進(jìn)行系統(tǒng)研究的需要，因此我們采用主動免疫動物的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗AT1R細(xì)胞外第二環(huán)抗體(AT1R-Ab)。但是，這種主動免疫產(chǎn)生的抗體是否可作為AT1-AA的替代品，還需要對其進(jìn)行鑒定。因此本課題設(shè)計如下：(1)利用免疫組化方法，檢測胎盤血管上AT1R的表達(dá)情況;(2)觀察從先兆子癇患者血清中提取的AT1-AA對人體胎盤血管的直接作用；(3)制備AT1R-Ab，鑒定其類型及亞類，觀察AT1R-Ab對人體胎盤血管功能的影響，并與AT1

4、-AA的作用進(jìn)行比較，以提供AT1R-Ab可替代AT1-AA進(jìn)行研究的依據(jù)；(4)探討AT1R-Ab引起人體胎盤血管收縮的可能機(jī)制。本研究將為探討AT1-AA可影響胎盤血流量而參與先兆子癇的發(fā)病提供重要的實驗依據(jù)。
　　 目的：⑴明確人體胎盤血管上AT1受體的表達(dá)情況；⑵觀察AT1-AA對于正常人體胎盤血管功能的影響；⑶鑒定免疫鼠血清中AT1R-Ab的抗體類型和亞類，觀察其對人體胎盤血管的作用，并與AT1-AA的功能效應(yīng)進(jìn)行比較

5、；⑷分析AT1R-Ab引起人體胎盤血管作用的機(jī)制。
　　 方法：利用免疫組化方法，定位人體胎盤血管上AT1R的表達(dá)情況；ELISA法檢測先兆子癇患者血清中的AT1-AA，并采用親和層析法提純AT1-AA陽性血清總IgGs；以合成的人AT1受體細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(AT1R-ECⅡ，165-191，純度為95％)為抗原主動免疫雌鼠，使其產(chǎn)生AT1R-Ab，ELISA法鑒定AT1R-Ab的類型和亞類；利用離體胎盤血管環(huán)實驗，觀察

6、AT1-AA對正常人體胎盤血管功能的影響，以及AT1R-Ab對正常人及先兆子癇患者胎盤血管功能的影響。
　　 結(jié)果：①免疫組化實驗結(jié)果顯示，在胎盤動脈、靜脈及血管內(nèi)皮細(xì)胞處均有明顯的黃染，說明有AT1R表達(dá)，而空白對照組沒有黃染情況。②從先兆子癇患者AT1-AA陽性血清提取獲得的IgGs(1mmol/L)，對離體正常人胎盤靜脈血管產(chǎn)生明顯的收縮作用(收縮幅度占同一血管KCl作用的百分比為13.33士0.9％)，與空白對照組相比有

7、顯著性差異(P＜0.01)。該作用能夠分別被抗人IgG抗體和AT1R-ECⅡ(AT1受體細(xì)胞外第二環(huán))表位肽段所逆轉(zhuǎn)。③用合成的AT1R細(xì)胞外第二環(huán)肽段免疫大鼠，誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗AT1R細(xì)胞外第二環(huán)的抗體(AT1R-Ab)，檢測免疫前后的血清AT1R-Ab的陽性率，發(fā)現(xiàn)第一次加強(qiáng)免疫后已有1只呈抗體陽性，第二次加強(qiáng)免疫陽性率達(dá)86％，第三次加強(qiáng)免疫后陽性率達(dá)100％。AT1R-Ab含量檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫4周時已明顯升高，8周時達(dá)峰值(稀釋度

8、1∶10時OD值2.89±0.11vs.同期對照組0.44±0.06，P＜0.01。④AT1R-Ab與AT1-AA均具有收縮胎盤靜脈血管的作用：AT1R-Ab和AT1-AA均能引起正常人胎盤靜脈血管收縮。且相同濃度(1mmol/L)的AT1-AA與AT1R-Ab作用于胎盤靜脈血管后收縮幅度百分比之間無統(tǒng)計學(xué)差異(13.33±0.9％vs.14.00±3.2％，P＞0.05)。⑤AT1R-Ab對胎盤靜脈與動脈具有同樣的血管收縮作用：10m

9、mol/LAT1R-Ab能增強(qiáng)胎盤動脈的最大收縮百分比為29.21±3.7％，增強(qiáng)胎盤靜脈的最大百分比為21.35±2.8％，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。⑥AT1R-Ab對人體胎盤的濃度依賴性縮血管作用：0.1、1和10mmol/L的AT1R-Ab可濃度依賴性使人體胎盤血管收縮，最大收縮百分比分別為2.73±1.1％、14.00±3.2％和33.30±5.6％，各濃度之間引起的收縮百分比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)(見圖9

10、)。1mmo1/L的AT1R-ECⅡ預(yù)孵血管后能有效逆轉(zhuǎn)AT1R-Ab的縮血管作用。⑦AT1受體而非AT2受體介導(dǎo)AT1R-Ab的縮血管作用。1mmol/L的losartan(AT1受體拮抗劑)可有效阻斷AT1R-Ab的縮血管作用(14.00±3.2％vs.-6.33±0.9％，P＜0.05)；而1mmol/L的PD123319(AT2受體拮抗劑)未能阻斷AT1R-Ab的縮血管作用(14.00±3.2％vs.13.50±3.3％，P＞0

11、.05)。⑧AT1R-Ab具有類似血管緊張素Ⅱ但持續(xù)時間較長的收縮胎盤血管作用：AT1R-Ab對胎盤血管的收縮作用與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)類似，且1mmol/L的losartan可有效阻斷AngⅡ的縮血管作用(-2.60±0.2％vs.8.11±1.6％，P＜0.05)；而1mmol/L的PD123319也未能阻斷AngⅡ的縮血管作用(6.98±1.7％vs.8.11±1.6％，P＞0.05)。⑨AT1R-Ab對先兆子癇患者的胎盤血管

12、具有濃度依賴性收縮作用：0.1、1與10mmol/L的AT1R-Ab引起的人體胎盤血管最大收縮幅度百分比分別為1.74±0.3％、5.58±1.4％和13.73±2.5％，各濃度的收縮百分比之間都具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。(見圖14)
　　 結(jié)論：⑴AT1R在人體胎盤血管上有一定的表達(dá)；⑵先兆子癇患者的AT1-AA具有直接收縮正常人胎盤血管的作用；⑶AT1R-Ab可以替代AT1-AA作為實驗工具；⑷AT1R-Ab能夠直接導(dǎo)