柔嫩艾美耳球蟲甘露醇合成相關(guān)酶M1PDH和M1Pase的生物學(xué)特性與酶動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、雞球蟲病是當(dāng)今家禽產(chǎn)業(yè)中普遍存在的疾病，主要是由胞內(nèi)寄生蟲艾美耳球蟲引起的，每年都會(huì)給養(yǎng)禽業(yè)造成很大的損失。完善對(duì)艾美耳球蟲的代謝過(guò)程的研究，可以為球蟲病的防控提供更多參考。甘露醇循環(huán)不僅提高了糖代謝能量的利用率，還保證了球蟲在非寄生階段所需的能量供給，且甘露醇的合成與代謝在高等真核生物中是沒(méi)有的，所以球蟲甘露醇循環(huán)相關(guān)酶可以成為較好的藥物靶標(biāo)。已有的研究表明艾美耳球蟲的甘露醇代謝合成酶M1PDH和M1Pase可能具有很高的催化活性，探

2、明這兩種酶的生物學(xué)與酶動(dòng)力學(xué)特性不僅可以為后續(xù)抗球蟲藥的開發(fā)提供參考，同時(shí)也為發(fā)展新的甘露醇合成技術(shù)打好基礎(chǔ)。
　　本研究根據(jù)GenBank上已公布的柔嫩艾美耳球蟲（Eimeiria tenella）甘露醇-1-磷酸脫氫酶(m1pdh)和甘露醇-1-磷酸酶(m1pase)的序列設(shè)計(jì)引物，以浙江株未孢子化艾美耳球蟲卵囊cDNA為模板擴(kuò)增得到目的片段，構(gòu)建原核表達(dá)體系表達(dá)重組蛋白。經(jīng)在線軟件預(yù)測(cè)與分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的m1pdh與已公布

3、的序列有7個(gè)堿基、5個(gè)氨基酸序列發(fā)生突變，預(yù)測(cè)該蛋白有6個(gè)跨膜螺旋區(qū)域但無(wú)跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)形成較多α螺旋和10個(gè)二硫鍵，其預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與弗氏志賀菌（Shigella flexneri）甘露醇-1-磷酸-5-脫氫酶(M1PDH5)三級(jí)晶體結(jié)構(gòu)有21.38％的同源性;浙江株E.tenella的m1pase基因與已公布的序列有2個(gè)堿基、1個(gè)氨基酸突變，經(jīng)預(yù)測(cè)該蛋白有有一個(gè)分值很高的跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其N-端很有可能位于膜外，也形成較多

4、α螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)和7個(gè)二硫鍵，為組氨酸磷酸酶家族成員之一，其預(yù)測(cè)的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與釀酒酵母(S.cerevisiae)磷酸甘油酸酯轉(zhuǎn)移酶-1(PM1)晶體結(jié)構(gòu)有23.35％的同源性。
　　利用已獲得的重組蛋白分別制備抗BL21-pET30a-M1PDH和抗BL21-pET30a-M1Pase的多克隆抗體，并對(duì)M1PDH和M1Pase在球蟲各生活史階段亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究。定位結(jié)果表明，M1PDH和M1Pase在裂殖子、裂殖體、配子體和子

5、孢子中均有表達(dá)，在裂殖體和配子體中M1PDH與M1Pase蛋白表達(dá)于細(xì)胞所有部位，無(wú)特定聚集部位;在裂殖子和子孢子中M1PDH與M1Pase蛋白表達(dá)于除細(xì)胞核所在區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)中。
　　為探究E.tenella的M1PDH和M1Pase兩酶在甘露醇合成過(guò)程中所起到的催化作用，本研究設(shè)計(jì)了以重組可融性蛋白代替天然蛋白，在體外進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，NADPH和NADH均可作為重組蛋白BL21-pET30a-M1PDH酶反應(yīng)的底

6、物，該蛋白的最佳反應(yīng)溫度為37℃，在以NADH為底物時(shí)M1PDH的Km值為199.05μM，Vmax為30.67μM/min;在以NADPH為底物時(shí)M1PDH的Km值為1772.10μM，Vmax為476.19μM/min;而重組蛋白BL21-pET30a-M1Pase的最佳反應(yīng)溫度為35℃，Km值為818.90μM，Vmax為91.74μM/min。與其他物種相同作用的酶相比較，艾美耳球蟲的甘露醇合成相關(guān)酶M1PDH和M1Pase具有