偽狂犬病毒變異株JS--2012感染性細(xì)菌人工染色體克隆的構(gòu)建及應(yīng)用.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(Pseudo rabies virus，PRV)感染多種家畜與野生動(dòng)物出現(xiàn)以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為特征的急性傳染病。該病曾在我國得到了有效控制，然而自2011年底了出現(xiàn)了PR新疫情并呈現(xiàn)出流行擴(kuò)大趨勢，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了難以估計(jì)的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)多家研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)證實(shí)這次爆發(fā)的PR新疫情是由PRV變異株引起。與經(jīng)典毒株變相比，變異株存在多個(gè)基因變異、毒力明顯增強(qiáng)。本研究以

2、PRV變異株為對(duì)象，成功構(gòu)建了PRV感染性細(xì)菌人工染色（Bacterial artificial chromosome，BAC）體操作平臺(tái)。
　　1.含有BAC載體重組PRV的構(gòu)建
　　本研究首先構(gòu)建一個(gè)含有EGFP表達(dá)盒及兩翼各一個(gè)loxp位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體pTEGGF，利用同源重組將其插入PRV JS-2012 gG編碼區(qū)下游，獲得重組病毒rJS2012-gG/EGFP。將表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒pcDNA3.1-cre轉(zhuǎn)染B

3、HK-21細(xì)胞后感染低劑量的重組病毒rJS2012-gG/EGFP，獲得含有單一loxp位點(diǎn)插入的重組病毒rJS2012-gG/loxp。提取重組病毒rJS2012-gG/loxp基因組與含有EGFP標(biāo)記基因的BAC載體pBeloBAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共轉(zhuǎn)染BHK-21，獲得含有BAC載體插入的重組病毒rJS2012-BAC。一步生長曲線與空斑實(shí)驗(yàn)顯示，重組病毒rJS2012-BAC在體外生長略慢于親本病毒PRV

4、 JS-2012。
　　2.PRV感染性BAC克隆的獲得及拯救病毒生物學(xué)特性研究
　　利用Hirt法提取重組病毒rJS2012-BAC環(huán)狀基因組，電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH10B中。通過PCR鑒定、RFLP分析，獲得包含PRV全基因組的BAC克隆pJS-2012BAC。將pJS-2012BAC轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得了拯救病毒vPRVJS-2012BAC。將pJS-2012BAC與pcDNA3.1-cre共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，獲得了BA

5、C載體刪除的無痕回復(fù)株vPRVJS-2012。通過研究親本毒PRV JS-2012、拯救病毒vPRVJS-2012BAC與刪除BAC載體拯救病毒vPRVJS-2012的體外空斑實(shí)驗(yàn)、一步生長曲線實(shí)驗(yàn);體內(nèi)小鼠致病性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明vPRVJS-2012BAC與親本毒相比體外復(fù)制速度有所減慢，而刪除BAC載體的無痕回復(fù)株vPRVJS-2012與親本毒PRV JS-2012相比，空斑大小和形態(tài)差異不顯著，一步生長曲線接近，對(duì)小鼠的致病性相同，

6、結(jié)果說明vPRVJS-2012與PRV JS-2012無論是在體內(nèi)還是在體外均保持了一致的生物學(xué)特性。
　　3.PRV感染性BAC克隆操作平臺(tái)的建立及初步應(yīng)用
　　本研究將pJS-2012BAC電轉(zhuǎn)入SW102菌株，經(jīng)過PCR鑒定、RFLP分析，成功篩選到含有pJS-2012BAC的SW102菌株陽性克隆SW102-PRVBAC。利用galk正篩選，將galk基因替換PRVgE/gI基因，經(jīng)PCR鑒定、篩選獲得陽性克隆SW1

7、02-galk。利用galk負(fù)篩選，將gE/gI左右同源臂替換galk基因，經(jīng)PCR鑒定、RFLP分析篩選獲得陽性克隆SW102-DgE/gI。將SW102-DgE/gI的BAC DNA pPRV-DgE/gIBAC轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞成功拯救出刪除gE/gI基因的病毒vPRV-DgE/gIBAC。將pPRV-DgE/gIBAC與pcDNA3.1-cre共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞成功拯救出刪除BAC載體和gE/gI基因的病毒vPRV-DgE/gI。

8、拯救病毒vPRV-DgE/gI與親本毒PRV JS-2012的空斑實(shí)驗(yàn)、一步生長曲線實(shí)驗(yàn)表明vPRV-DgE/gI的細(xì)胞間擴(kuò)散能力有所下降，復(fù)制速度有所減緩。
　　綜上所述，本研究首次構(gòu)建了未破壞PRV任何基因結(jié)構(gòu)的感染性細(xì)菌人工染色體克隆pJS-2012BAC，拯救病毒與親本毒體內(nèi)外生物學(xué)特性一致。利用pJS-2012BAC和galk正反篩選系統(tǒng)成功構(gòu)建了PRV感染性細(xì)菌人工染色體操作平臺(tái)，利用該平臺(tái)可以快速、高效、準(zhǔn)確的對(duì)PR