細菌介導的重組偽狂犬病毒(PRV)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)運哺乳動物細胞的方法研究.pdf

1、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)屬于皰疹病毒科的α-皰疹病毒亞科,其宿主范圍很廣,能有效感染多種哺乳動物和一些禽類,引起偽狂犬病,但不感染人和高級靈長類,豬是其自然宿主。偽狂犬病是危害全球養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一,如何預防和治療偽狂犬病是研究偽狂犬病病毒的首要目的；此外,偽狂犬病病毒還被作為研究皰疹病毒生物學的模式系統(tǒng),分析病毒的入侵、病毒粒子的包裝和胞外分泌以及神經(jīng)入侵等機制,PRV還作為“活”的追蹤劑,被用

2、于各種神經(jīng)通路的研究。
　　 PRV為雙鏈DNA病毒,基因組約為150 kb,在非必需基因區(qū)能容納大的外源DNA片段插入；此外,該病毒還具有高效感染神經(jīng)細胞并在神經(jīng)細胞中潛伏的能力,因此PRV適合作為疫苗和基因治療載體。作為載體,PRV在疫苗生產(chǎn)、基因和腫瘤治療等方面已有一些成功的嘗試,但是,利用哺乳動物細胞內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建重組PRV病毒是一項繁瑣的工作,皰疹病毒基因組BAC克隆的出現(xiàn)極大地簡化了重組PRV病毒的構(gòu)建方法,為

3、發(fā)展高效的重組皰疹病毒載體構(gòu)建技術奠定了基礎。
　　 本研究以PRV-BAC載體pBecker2為基礎,建立了利用交配輔助遺傳整合克隆(MAGIC)技術構(gòu)建重組PRV病毒載體和不依賴轉(zhuǎn)染的、利用大腸桿菌感染介導的PRV-BAC DNA轉(zhuǎn)入動物細胞獲得重組病毒粒子的方法,具體研究內(nèi)容如下:
　　 1.表達限制性內(nèi)切酶I-SceI的大腸桿菌DH10B-IS2的構(gòu)建
　　 構(gòu)建打靶質(zhì)粒pML294C,將pML294C中

4、約6 kb的umuC:araC-ParaBAD-I-SceI-FRT-npt-FRT片段酶切下來,電轉(zhuǎn)化已誘導Red-gam重組酶表達的大腸桿菌DH10B(pML300)。經(jīng)細胞內(nèi)同源重組得到araC-ParaBAD-I-SceI-FRT-npt-FRT插入染色體umuC基因中的重組大腸桿菌DH10B-ISK。將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B-ISK,溫度誘導Flp重組酶表達,篩選得到npt基因被敲除的kans大腸桿菌DH10B-

5、IS2,并驗證了該菌株表達的I-SceI內(nèi)切酶的功能。
　　 2.受體載體pBecker2-KH的構(gòu)建
　　 將kadr基因打靶盒式結(jié)構(gòu)(H1-I-SceI-kanr-I-SceI-H2)經(jīng)同源重組插入pBecker2的TK基因中,得到受體載體pBecker2-KH；進一步通過限制性圖譜分析、序列分析和Southern印跡分析,證明重組質(zhì)粒pBecker2-KH的結(jié)構(gòu)是正確的。將pBecker2-KH轉(zhuǎn)染PK-15細胞,

6、獲得了有感染能力的PRV病毒vBecker2-KH。
　　 3.通過MAGIC方法構(gòu)建重組偽狂犬病病毒載體
　　 將含供體質(zhì)粒pRTRA的供體菌DH10β和受體菌DH10B-IS2(pBecker2-KH、pML300)按比例混合,進行接合實驗；用添加了Amp(100μg/ml)、Cam(12.5μg/ml)和Ara(0.2％w/v)的LB固體平板培養(yǎng):用引物F5和Rsv40進行菌落PCR篩選重組克隆。PCR結(jié)果表明這些

7、隨機挑選的克隆中均含重組質(zhì)粒pBecker2一red。進一步通過限制性圖譜分析、序列分析和Southern印跡分析,證明重組質(zhì)粒pBecker2-red的結(jié)構(gòu)是正確的。
　　 將pBecker2-red轉(zhuǎn)染PK-15細胞,產(chǎn)生的細胞蝕斑呈現(xiàn)紅色熒光；從細胞中收獲了有感染能力的PRV病毒vBecker2-red。病毒一步生長曲線顯示重組病毒vBecker2-red和vBecker2-KH與親本vBecker2的體外增殖特征一致。<

8、br>　　 將PRRSV的ORF5通過MAGIC方法克隆至PRV BAC載體上,得到重組病毒載體pBecker2-05,經(jīng)轉(zhuǎn)染后獲得相應的重組病毒vBecker2-05。Western印跡檢測表明融合了His標簽的PRRSV ORF5蛋白在PK-15細胞中實現(xiàn)了表達。
　　 4.MAGIC方法構(gòu)建重組偽狂犬病病毒載體的效率分析
　　 構(gòu)建質(zhì)粒pRThGA,該質(zhì)粒與pRTRA供體質(zhì)粒不同的是:在兩個同源臂之間僅克隆了gf

9、p表達盒式結(jié)構(gòu),沒有串聯(lián)Ampr基因作為篩選標記。以pRThGA作為供體質(zhì)粒,進行接合實驗,然后用含Cam和Ara的LB固體平板培養(yǎng)；用引物F5和Rsv40進行菌落PCR,48個克隆中,有43個擴增得到了～1.7 kb的DNA片段,與gfp的表達盒式結(jié)構(gòu)的大小一致,表明這些克隆含有重組質(zhì)粒pBecker2-gfp；陽性率為89.4±8.5％。
　　 將pBecker2-gfp轉(zhuǎn)染PK-15細胞,產(chǎn)生的細胞蝕斑呈現(xiàn)綠色熒光:從細胞

10、中收獲了有感染能力的PRV病毒vBecker2-gfp。Western印跡檢測表明融合了His標簽的綠熒光蛋白在PK-15細胞中實現(xiàn)了表達。
　　 5.感染性大腸桿菌轉(zhuǎn)運PRV-BAC進入哺乳動物細胞的能力
　　 質(zhì)粒pGBΩinv-hly克隆有Yersinia pseudotuberculosis入侵素基因(inv)和Listeriamonocytogenes的李斯特溶菌素LLO基因(hly)。將質(zhì)粒pGBΩinv-h

11、ly分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(pBecker2)、DH10B(pBecker2-KH)和DH10B(pBecker2-red)獲得了感染性大腸桿菌DH10B-pBGih1、DH10B-pBGih2和DHl0B-pBGih3,用這3株大腸桿菌分別感染PK-15細胞,從中都獲得了PRV病毒粒子；病毒滴度分析表明這三株細菌轉(zhuǎn)運BAC DNA的效率相似。感染性大腸桿菌也將重組PRV-BAC載體pBecker2-O5轉(zhuǎn)運至PK-15細胞內(nèi),獲得

12、了相應的重組病毒。用DH10B-pBGihl分別感染PK-15、IBRS-2、Hela和Vero細胞,前三種細胞均會發(fā)生病變,而Vero細胞無病變出現(xiàn)。
　　 6.感染性大腸桿菌細胞感染條件的研究
　　 其最佳感染條件為:DH10B-pBGihl感染IBRS-2和Hela細胞的最佳時間均是60min,在60～150 min的范圍內(nèi),被感染細胞中釋放的病毒滴度差異不大；而細菌對IBRS-2和Hela細胞最佳的感染劑量分別為

13、900 MOI和600 MOI；在300～3000之間,IBRS-2細胞中釋放的PRV病毒量接近,而MOI在600～3000之間時,Hela細胞中釋放的PRV病毒滴度也無顯著差異。
　　 7.感染性大腸桿菌小鼠感染的研究
　　 將DH10B-pBGihl按1×109CFU的接種量、通過肌肉或腹腔注射BALB/c鼠,以vBecker2和pBecker2為對照,DH10B-pBGihl感染后,在小鼠的主要器官,如脾臟、肝臟和

14、腦組織的勻漿液中均沒有檢測到PRV病毒的存在。DH10B-pBGihl免疫小鼠后,也不能誘發(fā)小鼠的免疫應答,小鼠不能抵御強毒的攻擊,這表明感染性大腸桿菌不能有效的將PRV-BAC DNA轉(zhuǎn)運至小鼠的體細胞中。
　　 綜上所述,本研究建立了基于PRV-BAC的交配輔助遺傳整合克隆系統(tǒng),使用該系統(tǒng)構(gòu)建了幾種PRV重組病毒載體；還建立了通過大腸桿菌將PRV-BAC基因組DNA直接轉(zhuǎn)運至哺乳動物細胞的技術；這兩種技術結(jié)合使用,使獲得重組