豬偽狂犬病毒Fa株感染性細菌人工染色體克隆的構(gòu)建及體外生長特性研究.pdf

1、偽狂犬?。≒seudorabies,PR）又稱 Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alpha-herpesririnae）引起的多種動物的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）、繁殖障礙、神經(jīng)癥狀（腦脊髓炎）為主要臨床癥狀的高度致死性、急性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其歸為二類動物傳染病，是典型的極難防疫的自然異源性疾病，給全球畜牧業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。豬偽狂犬病毒（Pseudorabies

2、 virus，PRV）是豬偽狂犬病的病原，其基因組為雙股線性DNA，全長為150kb左右，有70-100種編碼蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子約含有50種蛋白質(zhì)。
　　長期以來，研究皰疹病毒基因功能的主要方法是通過構(gòu)建基因缺失突變株來實現(xiàn)的，但傳統(tǒng)的同源重組使構(gòu)建工作非常繁瑣，得到的突變株遺傳穩(wěn)定性差，使皰疹病毒的研究受到了限制。自從1999年，美國學者Gregoory等［1］成功構(gòu)建了偽狂犬病毒的全長感染性克隆以來，對皰疹病毒基因結(jié)構(gòu)和功

3、能的研究起到了巨大的推動作用，并為皰疹病毒作為高效載體系統(tǒng)的開發(fā)提供了嶄新的途徑。
　　本研究根據(jù)PRV Fa株的部分TK基因以及兩側(cè)的UL22、UL24基因擴增含有兩個Loxp位點的左、右同源臂，將獲得的左、右同源臂Fa TKA和Fa TKB替換本實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體pUC-TKA2-GFP-gpt-TKB（PRV流行毒株）中的TKA2和TKB，獲得PRV Fa株的中間轉(zhuǎn)移載體pUC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa

4、TKB,然后將pBeloBAC11載體線性化后插入到pUC-Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB中構(gòu)建了重組病毒轉(zhuǎn)移載體pUC- Fa TKAM-GFP-gpt-Fa TKB-BAC。將PRV Fa基因組DNA與重組病毒轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染Vero細胞，經(jīng)過3輪gpt加壓篩選和4輪噬斑篩選得到了純化的帶BAC質(zhì)粒的重組偽狂犬病毒rPRV-Fa-BAC。將純化的重組病毒 rPRV-Fa-BAC感染Vero細胞，適時提取環(huán)狀的重組病毒基因

5、組DNA，電轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細胞，通過BamHⅠ酶切鑒定篩選BAC分子化克隆，將陽性BAC克隆轉(zhuǎn)染Vero細胞得到拯救的重組病毒vPRV-BAC-Fa。重組病毒vPRV-BAC-Fa在Vero細胞上盲傳4代后，gpt加壓篩選標記基因和GFP綠色熒光基因仍然存在，通過PCR檢測插入的其它外源片段對以及PRV中的關(guān)鍵基因，并選擇部分基因進行序列測定，結(jié)果表明拯救的重組偽狂犬病毒vPRV-BAC-Fa得到了穩(wěn)定的遺傳。通過對親本毒PRV