無(wú)排卵型功血子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)及角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子干預(yù)研究.pdf

1、背景與目的：無(wú)排卵型功血(anovulatorydysfunctionaluterinebleeding，ADUB)與子宮內(nèi)膜止血機(jī)制缺陷有關(guān)，主要表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜修復(fù)障礙。子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)修復(fù)包括上皮再生與血管再生。目前尚無(wú)資料表明ADUB的子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)修復(fù)過(guò)程和機(jī)制是否與正常月經(jīng)相同。正常月經(jīng)子宮內(nèi)膜修復(fù)機(jī)制與傷口愈合機(jī)制相似，在大量調(diào)節(jié)因子的作用下完成。其中，KGF(keratinocytegrowthfactor，KGF)是特異性促進(jìn)

2、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)分化的因子，在上皮組織的生長(zhǎng)修復(fù)中起重要作用。KGF對(duì)ADUB子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(endometriumepithelialcell，EEC)的作用尚不清楚，其在月經(jīng)子宮內(nèi)膜再上皮化中的作用亦未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)在改進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法以分離培養(yǎng)無(wú)排卵型功血EEC并觀測(cè)其生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察KGF對(duì)無(wú)排卵型功血EEC生長(zhǎng)、分泌及雌、孕激素受體(ER、PR)表達(dá)的影響，探討KGF在ADUB子宮內(nèi)膜上皮生長(zhǎng)

3、修復(fù)過(guò)程中的作用。 方法：在取材、培養(yǎng)條件和細(xì)胞純化等方面對(duì)EEC的培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化，采用膠原酶消化、篩網(wǎng)分離及差速貼壁對(duì)無(wú)排卵型功血EEC進(jìn)行分離、純化及培養(yǎng)，并用光電鏡、免疫組化圖像分析進(jìn)行細(xì)胞鑒定、純度分析及ER、PR、增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)的灰度值測(cè)定，應(yīng)用四甲基偶氮唑法(MTT)、磁酶免測(cè)定分別進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、癌標(biāo)記抗原125(CA125)濃度的測(cè)定

4、以觀察其生物學(xué)特性。在此基礎(chǔ)上，用KGF干預(yù)無(wú)排卵型功血及正常EEC，觀察KGF干預(yù)前后MTT所測(cè)吸光度(OD值)、CA125濃度、PCNA及ER、PR的免疫組化灰度值及RT-PCR測(cè)定的mRNA表達(dá)等指標(biāo)變化。 結(jié)果： 1.改進(jìn)后的EEC原代培養(yǎng)法增加了可獲得的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞純度達(dá)95％，培養(yǎng)無(wú)一例發(fā)生污染。細(xì)胞培養(yǎng)至5～6天為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)間。 2.無(wú)排卵型功血EEC的培養(yǎng)成活率與正常增殖期EEC的相比無(wú)差異

5、(P＞0.05)，單純性增生過(guò)長(zhǎng)EEC的培養(yǎng)成活率高于增生期樣EEC的培養(yǎng)成活率(P＜0.05)。 3.光電鏡下觀察，無(wú)排卵型功血EEC與正常EEC外觀特征相似，有共同的細(xì)胞骨架標(biāo)志，且都有分泌現(xiàn)象；保留了在體組織的結(jié)構(gòu)特征，細(xì)胞膜及細(xì)胞器均有病理改變。 4.MTT結(jié)果顯示無(wú)排卵型功血組EEC的活力較正常組低(P＜0.05)。光鏡下觀察兩組細(xì)胞生長(zhǎng)周期一致，均在培養(yǎng)第7天開(kāi)始衰退。 5.無(wú)排卵型功血組CA125濃

6、度比正常組高(P＜0.05)；第7天仍呈上升趨勢(shì)。 6.免疫組化結(jié)果顯示從正常增殖期、增生期樣到單純性增生過(guò)長(zhǎng)子宮內(nèi)膜，其腺上皮ER、PR表達(dá)依次顯著下降，PCNA表達(dá)依次顯著增加(P＜0.05)。體外培養(yǎng)的無(wú)排卵型功血EEC的ER、PR蛋白及mRNA表達(dá)均較正常組低(P＜0.05)，與在體組織ER、PR的表達(dá)相一致；PCNA表達(dá)較正常組低(P＜0.05)，與在體組織PCNA的表達(dá)相反。 7.不同濃度的KGF均可增加無(wú)排

7、卵型功血及正常EEC的活性及CA125濃度(P＜0.05)，在50ng/ml時(shí)作用顯著增強(qiáng)(P＜0.05)。KGF低濃度(10ng/ml、20ng/ml)與高濃度(200ng/ml、500ng/ml/)對(duì)EEC的作用相當(dāng)(P＞0.05)。 8.KGF作用后無(wú)排卵型功血組及正常組的CA125濃度與EEC數(shù)量均呈正相關(guān)(ADUB組r=0.885，P＜0.01；正常組r=0.681，P＜0.05)。 9.50ng/mlKGF作

8、用后，無(wú)排卵型功血及正常組的PCNA、ER、PR的灰度值及ER、PRmRNA的光密度比值均顯著增高(P＜0.05)。 10.KGF作用后，無(wú)排卵型功血組EEC數(shù)量、CA125濃度及PCNA灰度值的增長(zhǎng)幅度均較正常組低(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.通過(guò)在取材、培養(yǎng)條件和細(xì)胞純化等方面改進(jìn)EEC的培養(yǎng)方法，首次成功分離培養(yǎng)了無(wú)排卵型功血EEC，為研究無(wú)排卵型功血EEC的特性和功能提供了一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)工具。

9、2.初步了解了原代培養(yǎng)的無(wú)排卵型功血EEC的生物學(xué)特征，其保留了在體組織的結(jié)構(gòu)和功能特征，體外增生水平低、分泌異常，可能與其結(jié)構(gòu)和功能的病理變化及生長(zhǎng)環(huán)境改變有關(guān)。 3.無(wú)排卵型功血子宮內(nèi)膜及體外培養(yǎng)EEC的ER、PR表達(dá)降低，提示其激素生理功能異常。 4.KGF促進(jìn)無(wú)排卵型功血及正常EEC的增生及分泌，其作用呈劑量依賴性，在50ng/ml時(shí)作用最強(qiáng)。 5.無(wú)排卵型功血EEC對(duì)KGF的反應(yīng)性較正常細(xì)胞低，可能與其