腹膜間皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)化生長因子在子宮內(nèi)膜異位癥粘連中作用研究.pdf

1、盆腹腔粘連是子宮內(nèi)膜異位癥（以下簡稱內(nèi)異癥）最常見的表現(xiàn)之一，是造成內(nèi)異癥患者疼痛、不孕等的常見原因，也是造成手術(shù)困難和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)升高的重要原因。內(nèi)異癥造成粘連的主要特點(diǎn)包括:1粘連發(fā)生率高:80％以上的初治患者存在不同程度的盆腔粘連，而復(fù)發(fā)性內(nèi)異癥，粘連的機(jī)會幾乎100%;2粘連程度重:內(nèi)異癥造成的粘連多為致密性的粘連，往往導(dǎo)致盆腔各個(gè)器官組織解剖結(jié)構(gòu)不清，手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)增大；3粘連造成的盆腔解剖變異，可以造成嚴(yán)重的后果如疼痛，不育和包裹性積

2、液；4術(shù)后粘連再形成發(fā)生率高，使得再次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增大。內(nèi)異癥粘連形成機(jī)制目前尚不明確。因此，研究內(nèi)異癥粘連的發(fā)生及其相關(guān)因素，對進(jìn)一步理解內(nèi)異癥的發(fā)生機(jī)制以及尋求有效的預(yù)防粘連的方法將有積極的意義。
　　 腹膜由表面的單層間皮細(xì)胞及其下的結(jié)締組織構(gòu)成。正常的腹膜修復(fù)過程是：當(dāng)腹膜受到創(chuàng)傷時(shí)，表面的間皮細(xì)胞壞死脫落，暴露出結(jié)締組織；局部的炎癥反應(yīng)和血液凝集釋放的趨化因子，將損傷部位周圍的正常間皮細(xì)胞和間皮母細(xì)胞新生的間皮細(xì)胞

3、，吸引到受損傷的部位，從而在受損傷的腹膜表面形成多個(gè)間皮細(xì)胞島;在纖溶作用的促進(jìn)下，這些間皮細(xì)胞進(jìn)一步分裂、增殖并覆蓋受損傷的腹膜表面,完成間皮化，形成新的腹膜。因此，腹膜的損傷愈合包括炎癥、凝血、血管化、纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、上皮化和創(chuàng)面攣縮等多個(gè)步驟，而周圍間皮細(xì)胞的增殖對于腹膜修復(fù)具有重要作用。上述過程的失衡就會導(dǎo)致?lián)p傷修復(fù)的障礙，并導(dǎo)致粘連的形成。
　　 腹膜問皮細(xì)胞、腹腔液及其中多種類型的細(xì)胞、細(xì)胞因子等構(gòu)成的腹腔微

4、環(huán)境對內(nèi)異癥病灶發(fā)生、發(fā)展及疾病相關(guān)的臨床癥狀具有一定的作用。目前諸多相關(guān)研究亦證實(shí)了內(nèi)異癥患者腹腔微環(huán)境的改變，且認(rèn)為盆腔內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制不僅涉及到隨經(jīng)血逆流進(jìn)入盆腹腔的子宮內(nèi)膜碎片及其特性的變化，而且還涉及到盆腹腔微環(huán)境中的細(xì)胞及細(xì)胞因子對異位內(nèi)膜細(xì)胞生長產(chǎn)生的相關(guān)作用。腹膜間皮細(xì)胞在腹膜損傷、修復(fù)及粘連形成機(jī)制中的具有重要作用。腹膜間皮細(xì)胞，對維持腹膜結(jié)構(gòu)完整性及維持腹膜局部纖溶活性起到重要作用，任何因素對腹膜的刺激，引起腹膜間皮細(xì)

5、胞的改變均可能導(dǎo)致腹膜粘連的形成。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)作為一類多功能的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化等多種作用，且與多種纖維病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。腹腔液中巨噬細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞等均可產(chǎn)生、分泌TGF-β。哺乳動物的TGF-β有3型，即TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，三者功能相似且互相依賴，其中TGF-β1被認(rèn)為是參與纖維化形成的主要細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中各種成分如膠原蛋白、纖維連接蛋白等合

6、成的增多及促進(jìn)新生血管的形成。TGF-β1經(jīng)過活化后與其特異性的細(xì)胞表面受體結(jié)合，通過胞內(nèi)信號途徑的逐級磷酸化過程啟動多種Smad成分，參與組織的纖維化形成。TGF-β1亦是一種強(qiáng)效的炎性趨化因子和免疫抑制物，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、誘導(dǎo)及刺激人單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞趨化，是纖維形成和新生血管形成的誘導(dǎo)物；能夠顯著抑制T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞功能，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能，在組織修復(fù)過程中是一種重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。Oosterlynck等發(fā)

7、現(xiàn)內(nèi)異癥患者腹腔液NK細(xì)胞活性降低，而腹腔液中TGF-β1水平升高，認(rèn)為內(nèi)異癥患者腹腔液NK細(xì)胞活性降低與TGF-β1活性升高有關(guān)，這亦提示TGF-β1與內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展具有一定相關(guān)性。
　　 近年來我院郎景和教授總負(fù)責(zé)的課題組對在位內(nèi)膜在內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，取得了一些重大突破:系統(tǒng)的論證了內(nèi)異癥在位內(nèi)膜在粘附、侵襲、血管形成、致炎性反應(yīng)等多方面與正常子宮內(nèi)膜相比,具有諸如超微結(jié)構(gòu)、基因、表達(dá)產(chǎn)物和機(jī)能狀態(tài)

8、的差異。因此我們認(rèn)為內(nèi)異癥患者返流至盆腔的子宮內(nèi)膜細(xì)胞對腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生影響，使得腹膜結(jié)構(gòu)發(fā)生異常而影響腹膜正常修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致腹膜粘連形成。那么內(nèi)異癥和非內(nèi)異癥患者腹膜間皮細(xì)胞之間有何功能差異、TGF-β1對腹膜間皮細(xì)胞有何作用、雌孕激素對TGF-β1有何影響、TGF-β1中和性抗體的應(yīng)用能否對異位癥病灶的發(fā)生、發(fā)展及粘連形成有作用，針對以上一系列問題進(jìn)行以下臨床基礎(chǔ)研究。
　　 研究目的：
　　 1.探討內(nèi)異癥患者腹膜

9、間皮細(xì)胞與正常腹膜間皮細(xì)胞差異。
　　 2.探討TGF-β1對腹膜間皮細(xì)胞生長活性及細(xì)胞周期影響。
　　 3.探討雌、孕激素對體外培養(yǎng)腹膜問皮細(xì)胞TGF-β1、smad3/7表達(dá)的影響。
　　 4.探討盆腹腔內(nèi)異癥裸鼠模型中TGF-β1抗體對裸鼠腹腔內(nèi)異癥病灶及粘連形成的影響。
　　 研究方法：
　　 1.體外培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞，并行細(xì)胞免疫組化及流式細(xì)胞鑒定分析。
　　 2.MTT法檢測T

10、GF-β1對腹膜間皮細(xì)胞生長活性影響:相同濃度TGF-β1、不同作用時(shí)間對于腹膜間皮細(xì)胞生長活性的影響；不同濃度TGF-β1、同一作用時(shí)間對于腹膜間皮細(xì)胞生長活性的影響。
　　 3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測TGF-β1對腹膜間皮細(xì)胞周期影響:相同濃度TGF-β1、不同作用時(shí)間對于腹膜間皮細(xì)胞周期的影響;相同作用時(shí)間、不同濃度TGF-β1對于腹膜間皮細(xì)胞周期的影響。
　　 4.采用細(xì)胞免疫組化法、Realtime-PCR、West

11、ernblot檢測雌、孕激素對體外培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1及Smad3、7表達(dá)的影響。
　　 5.建立盆腹腔內(nèi)異癥裸鼠模型;以TGF-β1抗體作用于內(nèi)異癥裸鼠模型，觀察裸鼠內(nèi)異癥病灶及粘連形成情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用側(cè)盆壁肉眼觀察正常腹膜組織，體外成功分離、培養(yǎng)內(nèi)異癥腹膜間皮細(xì)胞，而正常腹膜間皮細(xì)胞不易體外培養(yǎng);低濃度胰酶、短時(shí)消化是獲得良好均一性腹膜間皮細(xì)胞的適宜處理?xiàng)l件
　　 2.TG

12、F-β1對腹膜間皮細(xì)胞生長活性具有抑制作用，并表現(xiàn)出濃度依賴性。TGF-β1濃度≦2.5ng/ml時(shí)，TGF-β1降低腹膜間皮細(xì)胞的活性。TGF-β1＞2.5ng/ml時(shí)，TGF-β1降低腹膜間皮細(xì)胞生長活性的作用逐漸減弱。
　　 3.TGF-β1對腹膜間皮細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并表現(xiàn)出濃度依賴性。TGF-β1濃度≦2.5ng/ml時(shí)，TGF-β1抑制抑制腹膜間皮細(xì)胞增殖作用。TGF-β1＞2.5ng/ml時(shí)，TGF-β1抑制

13、腹膜間皮細(xì)胞增殖的作用逐漸減弱。
　　 4.不同濃度雌激素促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1和Smad3、Smad7的表達(dá)，具有濃度依賴性。
　　 5.不同濃度孕激素能抑制正常腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)，但不能干預(yù)內(nèi)異癥組腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)
　　 6.成功建立子宮內(nèi)膜異位癥裸鼠模型;TGF-β1抗體作用于內(nèi)異癥裸鼠模型可以降低裸鼠內(nèi)異癥病灶發(fā)生率;但沒有明顯減輕病灶處粘連形成程度。
　　 結(jié)論：<

14、br>　　 1.對于肉眼觀察正常腹膜組織的腹膜間皮細(xì)胞，內(nèi)異癥組較對照組體外培養(yǎng)更容易，提示內(nèi)異癥腹膜間皮細(xì)胞對體外環(huán)境適應(yīng)性增強(qiáng)。
　　 2.TGF-β1抑制腹膜間皮細(xì)胞生長活性及細(xì)胞周期，提示內(nèi)異癥腹腔環(huán)境中的細(xì)胞因子對腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生影響，引起腹膜間皮細(xì)胞的功能異常，可能是粘連形成中的一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。
　　 3.不同濃度雌孕激素影響TGF-β/Smad相關(guān)蛋白表達(dá)，雌激素對腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1和Smad3、S

15、mad7的表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用，而孕激素能夠降低正常腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，但對內(nèi)異癥腹膜間皮細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)無明顯干預(yù)作用，提示雌激素在內(nèi)異癥粘連形成可能起到重要作用。
　　 4.TGF-β1抗體可以降低內(nèi)異癥粘連的發(fā)生率;但對病灶粘連程度的減輕沒有明顯作用，提示TGF-β1可能是內(nèi)異癥粘連形成的早期階段的啟動環(huán)節(jié)，TGF-β1抗體通過阻斷TGF-β1對腹膜間皮細(xì)胞活性以及增殖的抑制作用從而可以降低粘連的發(fā)生，