人表皮細胞培養(yǎng)適宜條件的探討.pdf

1、背景:表皮細胞培養(yǎng)用于探討表皮生物學(xué)特性以及多種皮膚病的發(fā)病機理，也可用于皮膚藥理學(xué)，在燒傷外科及整形外科中亦有著廣闊的前景。人類進行表皮細胞體外培養(yǎng)已有100余年的歷史，很長時間內(nèi)不能解決人表皮細胞的體外長期大量培養(yǎng)問題，直到1975年Rheinwald和Green利用放射致死的3T3鼠成纖維細胞作為表皮細胞培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞，才使表皮細胞的體外長期培養(yǎng)擴增成為可能。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和組織工程學(xué)的迅猛發(fā)展，以及研究手段和實驗條件的進一

2、步改善，表皮角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)在理論和技術(shù)上都有了不斷的發(fā)展和完善。 關(guān)于表皮細胞體外培養(yǎng)的適宜方法和條件，國內(nèi)外已有不少報道。然而，關(guān)于表皮細胞的分離液成分方面對表皮的克隆形成率，融合天數(shù)等細胞生物學(xué)性質(zhì)的影響卻缺乏深入的對比研究。為建立適宜的穩(wěn)定培養(yǎng)條件，包括滋養(yǎng)層問題，培養(yǎng)液內(nèi)容問題，尤其是關(guān)于表皮細胞分離液成分等問題，我們對正常人表皮生物工程中的適宜條件進行了探討。此外，為了獲得更多的表皮深層細胞，我們還對分離表皮后的表皮

3、細胞通過不同孔徑的尼龍布紗網(wǎng)過濾，對比不同的尼龍布紗網(wǎng)濾過的表皮細胞中深層細胞(主要指表皮干細胞)與中、淺層細胞的比例，為有關(guān)表皮生物學(xué)進一步提供理論資料并為表皮生物工程研究奠定實驗基礎(chǔ)。 材料與方法:標(biāo)本均取自我院2005年5月-2005年8月泌尿外科門診及住院包皮過長患者4例。年齡24-35歲。經(jīng)各項檢查證實無心、肝、肺、內(nèi)分泌、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤。以NIH-3T3細胞作為滋養(yǎng)層，以熱溶素分離表皮與真皮，分離表皮細胞應(yīng)用4組

4、不同濃度的胰蛋白酶(T)和EDTA(E)消化液：組①：0.05％T+0.02％E，組②：0.25％T+0.02％E，組③：0.05％T+0.1％E和組④：0.25％T+0.1％E。表皮細胞接種于DMEM-F12的含8種營養(yǎng)成分的完全培養(yǎng)液中，計錄接種表皮細胞的克隆形成數(shù)，擴增倍數(shù)以及融合時間。另外，對4種不同篩網(wǎng)過濾后的表皮細胞進行瑞氏染色，比較深層細胞與非深層細胞的百分數(shù)。 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS12.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分

5、析。兩樣本均數(shù)間用t檢驗，多樣本均數(shù)間用方差分析，變量間的相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，數(shù)據(jù)表達用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示。 結(jié)果:1.接種表皮細胞的克隆形成率和擴增倍數(shù)分別為：組①為10％和500倍，組②為7％和350倍，組③為17％和850倍，組④為14％和700倍。4組兩者之間皆有顯著性差異，(P＜0.05)。同一濃度EDTA組間相比，0.05％胰蛋白酶組的表皮細胞的

6、克隆形成率及擴增倍數(shù)皆高于0.25％胰蛋白酶組者，(P＜0.05)。接種表皮細胞的融合時間：組①為第10天，組②為第13天，組③為第10-11天，組④為第12天。4組的接種表皮細胞克隆形成率與融合天數(shù)之間未見顯著相關(guān)性(r=0.212，P＞0.05)。 2.應(yīng)用240目篩網(wǎng)組過濾的表皮細胞中深層細胞占24％，而300目與350目篩網(wǎng)組過濾的表皮細胞中深層細胞分別占52％和53％，300目或350目篩網(wǎng)過濾的表皮細胞中深層細胞可占

7、50％以上，顯著高于240目的24％，240目與300目或350目組者之間分別具有顯著性差異(P＜0.05)；而300目與350目組之間無顯著性差異(P＞0.05)；400目者效果反而不佳，經(jīng)400目篩網(wǎng)過濾后表皮細胞欠完整，且見更多的中、淺層細胞。 3.當(dāng)日新鮮的包皮組織經(jīng)消化后的表皮細胞活力百分率為85.2％；過夜的包皮組織的表皮細胞活力百分率為79.3％。兩者間有顯著性差異(P＜0.05)。當(dāng)同新鮮的包皮組織經(jīng)消化后的表皮

8、細胞活力百分率高于過夜的包皮組織的表皮細胞活力百分率。 4.經(jīng)刮真皮獲得的表皮細胞深層細胞百分率為35％；不刮真皮后獲得的表皮細胞深層細胞百分率為25％。兩者間有顯著性差異(P＜0.05)。經(jīng)刮真皮比不刮真皮后獲得到較高的表皮細胞深層細胞百分率。 小結(jié):1。同一濃度的EDTA作用下0.05％胰蛋白酶比0.25％胰蛋白酶更有利于表皮細胞克隆的形成和融合。此外，我們還發(fā)現(xiàn)表皮細胞的克隆形成率與融合天數(shù)之間未見顯著相關(guān)性，提示