人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下生物學(xué)特征的研究.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cell，hMSCs)，通過hMSCs在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下的生物學(xué)特征研究，探討人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為精原細(xì)胞的可行性，為hMSCs作為“種子細(xì)胞”開辟新的途徑。 方法： 1．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離純化、培養(yǎng)與鑒定：無(wú)菌條件下取出脛骨，沖出骨髓液，以Ficoll密度梯度和差速貼壁相結(jié)合的方法分離、培養(yǎng)hMSCs。待細(xì)胞鋪滿瓶底面積的

2、70％-80％，即進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化，離心，重懸細(xì)胞并按1：3的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)，并分別用P2、P3、P4等表示傳代次數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過下列方法鑒定： (1)倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生物學(xué)行為變化； (2)繪制hMSCs的生長(zhǎng)曲線：選取生長(zhǎng)良好的第2、4、9代細(xì)胞用0.25％胰酶消化后以1×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，并從第2天起，每天在固定時(shí)間，選用5孔細(xì)胞分別加入5

3、mg/ml的MTT20μl，混勻，孵育4h后棄培養(yǎng)液，加入150μl二甲基亞砜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)其OD值，取平均值，連續(xù)6d，以時(shí)間為橫軸、OD值為縱軸繪制不同代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線； (3)組織學(xué)染色將第三代的細(xì)胞培養(yǎng)4天后經(jīng)4％多聚甲醛固定并作常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色； (4)CD44、CD105免疫組化檢測(cè)將第三代細(xì)胞培養(yǎng)3天后，經(jīng)4％多聚甲醛固定并檢測(cè)細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)記。 2．人胚胎

4、MSCs在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)及檢測(cè)： (1)人胚胎MSCs在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)：取生長(zhǎng)良好的第三代hMSCs，用0.25％的胰酶/0.02％EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，將其加入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入濃度約為4×104/ml的細(xì)胞懸液1ml，將其隨機(jī)分組進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照組：用普通培養(yǎng)基(DMEM+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素+10％胎牛血清)培養(yǎng)，3-4d換液一次，共培養(yǎng)15d；實(shí)驗(yàn)組：用條件培養(yǎng)基(普通培

5、養(yǎng)基中添加1％人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG)+0.1U/ml胰島素+0.1g/L維生素A+0.1g/L維生素E+1％谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸鈉)誘導(dǎo)培養(yǎng)hMSCs，3-4d換液一次，共培養(yǎng)15d。 (2)人胚胎MSCs在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后結(jié)果檢測(cè)：在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化并拍照記錄，待細(xì)胞培養(yǎng)至第15d，采用SP法進(jìn)行細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)

6、，并嚴(yán)格按照說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，封片、鏡檢并拍照記錄。 結(jié)果： (1)原代培養(yǎng)的人胎兒骨髓MSCs在基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)4h后開始變形貼附，經(jīng)過約4d的靜止期后，于培養(yǎng)第5d后開始進(jìn)入快速增殖階段，即對(duì)數(shù)增殖期，此時(shí)可見細(xì)胞折光性增強(qiáng)，呈旋渦狀或巢狀生長(zhǎng)，細(xì)胞突起明顯增長(zhǎng)，相互交織，培養(yǎng)至9-10天即可鋪滿瓶壁。待傳至第三代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)趨于一致。此時(shí)hMSCs靜止期縮短，培養(yǎng)2-3d即進(jìn)入快速增殖期，第5d起，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸

7、緩慢，開始進(jìn)入平臺(tái)期。HE染色可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭行，胞質(zhì)豐富，核大，單個(gè)，圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示CD44、CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，Oct-4、C-kit呈陰性。 (2)人胚胎MSCs在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)過程中細(xì)胞大量死亡、脫落，而存活的細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，于培養(yǎng)第15天時(shí)可見細(xì)胞突起變少變短，有的甚至看不到突起，胞體由長(zhǎng)梭形變成圓形或橢圓形。免疫組織化學(xué)顯示此時(shí)的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)Oct-

8、4、C-kit染色呈陽(yáng)性，而CD44、CD105呈陰性表達(dá)。對(duì)照組：培養(yǎng)至第15天，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，免疫組織化學(xué)檢測(cè)Oct-4、C-kit染色呈陰性，CD44和CD105呈陽(yáng)性。 結(jié)論： 1．Ficoll密度梯度和差速貼壁相結(jié)合的方法可獲得純化的hMSCs，通過傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至第10代，細(xì)胞仍生長(zhǎng)良好，未出現(xiàn)老化現(xiàn)象，從而成功地建立了hMSCs的體外培養(yǎng)體系； 2．通過不同代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的研究，發(fā)現(xiàn)傳至第三代

9、的人胚胎MSCs純度高、增殖能力強(qiáng)，是實(shí)驗(yàn)選用的理想細(xì)胞； 3．倒置顯微鏡下細(xì)胞生物學(xué)行為觀察、HE染色、特異免疫組化顯示表面分子標(biāo)志物CD44、CD105為陽(yáng)性表達(dá)等方法有助于鑒定hMSCs； 4．人胚胎MSCs在精原細(xì)胞培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞突起變少變短，甚至看不到突起，胞體由長(zhǎng)梭形變成圓形或橢圓形。免疫組織化學(xué)顯示此時(shí)的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)Oct-4、C-kit染色呈陽(yáng)性，而CD44、CD105呈陰性