水稻無孢子生殖相關(guān)基因的研究.pdf

1、從簡化種子生產(chǎn)程序考慮，今后雜交水稻育種的策略將沿三系法、兩系法和一系法二個階段發(fā)展(袁隆平，1988)。其中，所謂一系法便是借助無融合生殖途徑固定雜種優(yōu)勢。無孢子生殖是普遍存在于草類植物的一種無融合生殖方式，其特征是：大孢子母細(xì)胞正常并發(fā)育成單倍體胚囊，其周圍的二倍體珠心細(xì)胞發(fā)育成大小與大孢子母細(xì)胞相近的無孢子生殖起始細(xì)胞，這些細(xì)胞不經(jīng)過減數(shù)分裂直接發(fā)育成二倍體胚囊，從而實(shí)現(xiàn)無孢子生殖。但在水稻中尚未發(fā)現(xiàn)這一生殖現(xiàn)象。敲除多胞囊基因(

2、MULTIPLESPOROCYTES，MSP1)的水稻突變體mspl，在胚珠中雖能產(chǎn)生多個大孢子母細(xì)胞，然而其花粉囊絨氈層不發(fā)育，只形成額外小孢子母細(xì)胞，結(jié)果表現(xiàn)雄性不育，不能繁種。 針對這一問題，本論文研究了與無孢子生殖特性相關(guān)的水稻基因，探索了人工合成水稻無孢子牛殖的材料和方法，試圖為實(shí)現(xiàn)固定水稻雜種優(yōu)勢提供一條重要的途徑。主要研究結(jié)果包括： 1．通過tBLASTn搜索水稻數(shù)據(jù)庫，作者在日本晴(O.sativa．su

3、bsp．japonica．cv.Nipponbare)基因組中發(fā)現(xiàn)2個絨氈層決定基因(TAPETUMDETERMINA.NT1，TPD1)OsTDL1A和Os7DL1B，它們與擬南芥TDPD1同源。RT-PCR結(jié)果顯示，在幼穗中OsTDL1A和OsTDLLB與MSP1基因共表達(dá)。RNA原位雜交表明，這些基因的表達(dá)部位有差異。OsTDLIA和MSP1在大孢子母細(xì)胞周圍的珠心細(xì)胞和小孢子母細(xì)胞周圍的花粉囊囊壁細(xì)胞中均表達(dá)，而OsTDL1B僅

4、在花粉囊囊壁細(xì)胞中表達(dá)，胚珠組織中并不表達(dá)。同時基于酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)分析顯示了這兩個基因編碼蛋白功能上的差異。OsTDLIA編碼蛋白能與MSP，基因編碼的富亮氨酸重復(fù)區(qū)域互作，而OsTDL1B卻不能。通過RNA干擾技術(shù)抑制轉(zhuǎn)化株OsTDL1A基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果引發(fā)多個大孢子母細(xì)胞出現(xiàn)，而花粉囊仍然保持正常，由此推測，胚珠內(nèi)的大孢子母細(xì)胞數(shù)目受MSP1與配體OsTDL1A的基因互作控制?；谏鲜鰧?shí)驗，作者認(rèn)為，應(yīng)用RNA干擾技

5、術(shù)產(chǎn)生的水稻OsTDLIA-RNA干擾系將成為人工合成水稻無孢子生殖的重要材料。 2．通過ClaustalW多序列比對，發(fā)現(xiàn)栽培稻和不同基因組野生稻MSP1基因非編碼區(qū)序列具有高度的保守性，通過聚類分析可將供試的6個基因組野生稻分成2群。其中AA基因組3個種為一群，它們間的序列同源性高達(dá)97.7％。另一群中CC、CCDD、EE基因組間的序列同源性為98％，它們與BBCC的親緣關(guān)系比GG更近；這為研究水稻不同基因組的進(jìn)化提供了線索

6、。通過轉(zhuǎn)錄分析糾正了NCBI對MSP1上游基因注釋的錯誤，其實(shí)這是MSP1的5′非翻譯區(qū)，MSP1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)應(yīng)位于Nonomura等(2003)克隆的全長cDNA序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2281bp。進(jìn)一步應(yīng)用雙向電泳和質(zhì)譜分析研究其編碼蛋白的分離及其表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水稻大孢子母細(xì)胞時期(3mm幼穗)，日本晴(野生型)和msp1突變體間，共顯示9個差異蛋白。與野生型相比，突變體中P1的分子量降低，P2的等電點(diǎn)升高，出現(xiàn)了日本晴中未顯示的P

7、3蛋白，P4、P5、P6表達(dá)量下調(diào)，而P7、P8、P9上調(diào)。作者推測MSP1激酶域作為負(fù)調(diào)節(jié)物，可能導(dǎo)致下游冷激蛋白的磷酸化，而抑制信號傳導(dǎo)。 3．首次發(fā)現(xiàn)水稻基因組中存在2個腈水解酶基因(OsNITA和OsNITB)，它們成簇分布在2號染色體上，與擬南芥．NIT4基因聚為一類。OsNITA和玉米ZmNIT2的同源性(92％)高于OsNITB和．ZmNHY的同源性(81％)。通過RT-PCR顯示，2個水稻腈水解酶基因能在根、莖、

8、葉及幼穗等多種組織中表達(dá)，但在表達(dá)量上有差異，OsNITA明顯高于OsNITB。利用RNA原位雜交技術(shù)檢測了兩基因在水稻根尖(種子萌發(fā)后lOd)和幼穗(大孢子母細(xì)胞時期)中的表達(dá)部位。結(jié)果表明，OsNITA在根尖分生組織區(qū)有較強(qiáng)的雜交信號，而在根冠和伸長區(qū)不表達(dá)，OsNITB的表達(dá)模式與OsNITA相似，但信號很弱。OsNITA在胚珠內(nèi)的珠心細(xì)胞中表達(dá)，而在大孢子母細(xì)胞內(nèi)未檢測到雜交信號。在花粉囊的表達(dá)主要集中于內(nèi)層、中層和絨氈層，維管