MAGE-3原核表達(dá)載體pET30a(+)-MAGE-3的構(gòu)建和表達(dá).pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文MAGE-3原核表達(dá)載體pET30a(+)-MAGE-3的構(gòu)建和表達(dá)姓名：付慶申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：趙國(guó)強(qiáng);王中全20040513鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文 M A G E ．3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)p E T 3 0 a ( + ) 同時(shí)用X h oI 酶切，電泳膠回收純化后對(duì)線性載體p E T 3 0 a ( + ) 進(jìn)行去磷酸化處理，將線性載體與目的基因連接，轉(zhuǎn)化B L 2 1 ( D E 3

2、) ，篩選出陽(yáng)性菌落，通過(guò)引物T 7 ／M P 2 鑒定出陽(yáng)性克隆( 正插重組子) ，并進(jìn)行D N A 測(cè)序；轉(zhuǎn)化菌經(jīng)I P T G誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)1 2 ％S D S ．P A G E 凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色及W e s t e r n b l o t 鑒定表達(dá)情況。結(jié)果：1 ．靶基因擴(kuò)增及酶切鑒定：通過(guò)R T - P C R 擴(kuò)增得到約O ．9 5 k bM A G E 一3 全長(zhǎng)編碼序列，并分別經(jīng)H i n dI I I S HE

3、 c o R I 酶切鑒定，結(jié)果與預(yù)期相符。2 ．克隆和亞克隆重組子結(jié)果鑒定：靶基因與p G E M —T E a s y 質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化J M l 0 9 ，藍(lán)白篩選后隨機(jī)選擇6 個(gè)陽(yáng)性菌落以T 7 ／S P 6 作為引物進(jìn)行P C R 擴(kuò)增，均得到長(zhǎng)于約為1 ．1 k b 的擴(kuò)增片段，均為陽(yáng)性克隆。將去磷酸化的p E T 3 0 a ( + ) 雙粘質(zhì)粒與雙粘靶片段M _ A G E 一3 連接，轉(zhuǎn)化B L 2 1 ( D E 3

4、 ) ，對(duì)9 個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行以T 7 ／M P 2 為引物的P C R 擴(kuò)增，有三個(gè)菌落的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1 ．2 k b ，為陽(yáng)性克隆( 正插重組子) 。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行D N A 測(cè)序證實(shí)，我們所克?。瘉喛寺〕龅腗 A G E ．3 基因片段的堿基組成與G e n B a n k 公布的M A G E ．3 N M 0 0 5 3 6 2 基因序列完全一致。3 ．p E T 3 0 a ( + ) ．M A G E ．3 在B L 2

5、 1 ( D E 3 ) 中表達(dá)：轉(zhuǎn)化菌經(jīng)I P T G 誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)1 2 ％S D S —P A G E 凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色及W e s t e r n b l o t 鑒定，證明了M A G E ．3蛋白的成功表達(dá)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)方法，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體p E T 3 0 a ( + ) - M A G E - 3 ，并誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)的成功表達(dá)。通過(guò)此項(xiàng)研究，得到了M A G E 一3 全蛋白抗原，為以M