免疫印記法檢測宮頸液基細胞中HPV 16、18 E6癌基因的表達及其意義.pdf

1、宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，研究發(fā)現幾乎所有的宮頸癌患者均伴有人乳頭瘤病毒(human papillomaviruses，HPV)感染，其中以HPV 16、HPV18與宮頸癌(cervical cancer)發(fā)病的關系最為密切，被稱為“高危型”。有關HPV促進宮頸細胞惡變的機制，目前公認病毒DNA整合到宿主細胞基因組中可能是細胞發(fā)生惡變的重要步驟，而E6是一個具有重要轉化特性的癌基因。本研究在宮頸液基細胞學檢查(Liquid-based

2、 Cyology TestLCT)、組織病理診斷的基礎上，在國內首次應用Western blot方法檢測了38例子宮頸癌、52例宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及16例正常對照者宮頸液基細胞中HPV16、18 E6癌基因的表達，以探討HPV16、18 E6在子宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學意義及該檢測方法的臨床應用價值，試圖為提高高危HPV感染的檢出率、隨訪監(jiān)測其是否持續(xù)存在，進而

3、對宮頸癌預警和早期診斷提供更科學有效的方法。 材料和方法 1．材料 1．1研究對象： 6251例行宮頸液基細胞學檢查的患者來自2004年11月-2005年8月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科門診，年齡21-76歲，平均45.53歲。無宮頸手術史、未孕、無盆腔放射治療史。 用于Westem blot分析的106例宮頸液基細胞標本系上述部分病人LCT檢查殘液，以組織病理診斷結果為分組依據。38例宮頸癌、5

4、2例CIN患者及16例對照組，年齡26～72歲，平均年齡48.4歲。其中宮頸鱗癌(cervical squamous cell carcinoma，cscc)30例、宮頸腺癌(cervical adencar-clnoma,CAC)8例、CINⅢ24例、CIN Ⅱ12例和CIN I 16例。 1．2主要試劑、儀器和來源 AutoCyte Prep液基細胞自動成片系統及實驗所用試劑由新順國際有限公司提供。垂直式電泳儀及

5、轉膜裝置，由美國BIO-RAD公司制造；兔抗人HPVl6、18E6抗體(一抗)和羊抗兔IgG-HRP(二抗)，購于美國Santa Cruze公司；低分子量標準蛋白質，購于上海寶信生物技術公司；DAB顯色．劑購于福州邁新生物技術公司；β-actin購于北京中杉金橋生物技術有限公司。 2．方法： 2．1 LCT檢查：臨床醫(yī)生常規(guī)采樣，全部洗脫至盛有l(wèi)Oml細胞保存液的收集瓶內，按儀器操作說明制片，由二位有經驗的細胞病理醫(yī)生讀

6、片，進行TBS(the Bethesda system)診斷。 2.2陰道鏡及組織病理檢查：對403例LCT診斷異常者(如：ASCUS及以上病變等)進行陰道鏡檢，并對宮頸可疑部位進行4點以上的組織活檢。每例活檢樣本由有經驗的病理學醫(yī)師做出病理診斷報告。 2．3 Western blot檢測宮頸液基細胞中HPVl6、18E6癌基因表達： 106例宮頸液基細胞標本分別加全細胞裂解液，低溫超聲粉碎后，高速低溫離心提取

7、上清蛋白。15％SDS-PAGE凝膠電泳、轉印、封閉后，加人相應的一抗、二抗及DAB顯色劑檢測。結果判定為轉印膜上出現清晰的棕色條帶為HPVl6、18E6癌基因表達陽性，并用分析軟件測定蛋白條帶的灰度值。 3．統計學分析 對HPVl6、18E6表達結果采用兩樣本X<'2>檢驗。P<0.05有統計學意 結果： 1．6251例婦科門診患者經LCT檢查：共檢出陽性病例(包括ASCUS、LSIL、HISL、

8、cc)1225例，CC占0.93％。檢出HPV感染(有特異性的挖空細胞出現)301例(4.82％)，主要分布在LSIL中，隨著宮頸病變的加重挖空細胞的陽性檢出率明顯下降，至CC時為0。 2．LCT與組織病理診斷符合率隨宮頸病變的加重而顯著上升，其中Ascus為33.3[％]、Lsil為52.8[％]、Hsil88.9[％]、而Scc則為100[％]。在140例Lsil中有13例診斷為高級別cin(CinⅡ11例、Cin Ⅲ2例

9、包括一例原位癌)，135例hsil中有5例診斷為cc。 3．Western Blot方法檢測hpv16、18 E6癌基因在各組宮頸液基細胞中有不同程度的表達:在Cscc、Cacc中,Hpv16、18 E6陽性表達率分別為76.7[％](23/30)和87.5[％](7/8)與16例正常宮頸液基細胞中hpv16、18 E6蛋白表達(6.3[％],)比較，有非常顯著性差異(P<0.01)；在52例cin中Hpv16、18 E6表達陽性

10、率為51.9[％]，與對照組比較有非常顯著性差異(P<0.01)；其中Cin Ⅱ和Ⅲ組Hpv16、18 E6蛋白表達陽性率分別為50.0[％]和62.5[％]，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而Cin Ⅰ的表達(37.5[％])與對照組比較無明顯差異(P>0.05)。 4．用分析軟件測定蛋白條帶的灰度值進行半定量分析顯示：Hpv16、18e6癌基因在各組中的表達量隨著宮頸病變的加重而增加,即：Cc>CinⅢ>Cin

11、 Ⅱ>Cini。與對照組比較，Cscc、Cacc、CinⅢ組有非常顯著性差異(P<0.01)；CinⅡ組的差異有統計學意義(P<0.05)，而CinⅠ與對照組比較無明顯差異(P>0.05)。 子宮頸癌是危及婦女生命的主要疾病，Hpv是子宮頸癌肯定的發(fā)病原因，從一般宮頸癌前病變發(fā)展成宮頸癌約需10年。因此，開展Hpv感染和宮頸病變的篩查十分必要。 Lct是宮頸病變篩查的主要手段，但并非檢測Hpv感染的理想方法。這主要是因為

12、：在細胞學中作為Hpv感染依據的挖空細胞不適應在未成熟的細胞中生長，隨著宮頸病變的加重，Hpv復制減少，挖空細胞的陽性檢出率將明顯下降。此外，Lct也受到取材方法的限制和主觀因素的影響，對宮頸病變的診斷存在一定的不明確結果和假陰性病例。 目前，診斷Hpv感染的主要方法是hpv Dna的檢測。大量研究已經表明，在100余種hpv中，致癌作用最強的是高危型Hpv16、18，其編碼的E6蛋白可與抑癌基因p53結合，導致Dna損傷后修復

13、障礙，從而引起宮頸組織增殖失控和誘發(fā)子宮頸癌發(fā)生。因此,對Hpv16、18e6檢查可以全面反應Hpv16、18感染的情況。在本研究中，我們首次在國內采用Western blot方法對宮頸液基細胞中HPV16、18 E6的表達進行了檢測，同時，利用分析軟件對各組中電泳條帶的灰度值(代表HPV16、18 E6負荷量)進行了分析。結果顯示：CSCC和CACC宮頸液基細胞中HPV16、18 E6癌基因表達陽性率高，負荷量大；隨CIN嚴重程度的增

14、加，HPV16、18 E6表達陽性率及負荷量也增大，提示CSCC和CACG宮頸液基細胞中存在HPV16、18 E6感染，HPV16、18 E6的檢測可以預測CIN的演變和進一步發(fā)展的可能性。此外，該檢查方法還可以作為LCT檢查的補充，有的放矢地指導ASCUS和LISI中HPV16、18E6陽性者做陰道鏡及活組織檢查，以降低LCT檢查的漏診率。故本方法可以作為臨床常規(guī)檢測宮頸病變的輔助方法。同時本研究還為臨床診斷宮頸是否存在HPV16和1

15、8型的感染找到一種簡便、易得的標本途徑。本研究結果還進一步證明HPV16、18 E6癌基因與子宮頸癌發(fā)生及CIN發(fā)展密切相關，為研究HPV16、18 E6癌基因致癌機理與其相關疾病的基因治療也提供了依據。 1．LCT是篩查宮頸癌及癌前病變的主要方法之一，但并非診斷HPV感染的理想方法。與組織病理檢查比較，該法對HISL及SCC有較高的診斷準確率，而對LSIL的診斷準確率較低，并且存在不確定的診斷結果。 2．宮頸液基細