肺動脈高壓患者蛋白質(zhì)組學及預后研究.pdf

1、第一部分:特發(fā)性肺動脈高壓患者肺組織蛋白質(zhì)組學研究及Transgelin表達差異驗證
　　目的:特發(fā)性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH)是指由不明原因引起的肺血管疾病，其主要特征是肺血管重塑，肺動脈壓力漸進性增高，目前發(fā)病機制尚未清楚。隨著蛋白質(zhì)組學理論和技術(shù)的發(fā)展和完善，使人們可以組織或細胞的蛋白質(zhì)整體表達水平研究疾病。本研究應用iTRAQ多重化學標記-串

2、聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，觀察分析正常對照組與特發(fā)性肺動脈高壓患者肺組織差異蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)組學水平探討肺動脈高壓形成機制。
　　方法:入選6例接受肺移植手術(shù)的IPAH患者，在術(shù)中取肺組織標本;并入選6名需接受肺部或臨近部位手術(shù)，可取得肺組織的患者作為正常對照組。入選的IPAH患者均進行右心導管檢查確診存在肺動脈高壓。提取肺組織總蛋白，bradford方法定量。丙酮沉淀蛋白以及胰蛋白酶酶解之后，用iTRAQ試劑標記，對照組，IPAH組分別用11

3、4，115標記。用AB SCIEX TripleTOF5600質(zhì)譜儀檢測差異蛋白，獲得差異蛋白的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖。對鑒定到的差異蛋白進行生物信息學分析，進行蛋白質(zhì)功能富集分析，蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析，以及蛋白質(zhì)相互作用通路分析。根據(jù)生物信息學結(jié)果和文獻閱讀，選取可能與IPAH發(fā)病機制有關(guān)的差異蛋白，進行免疫組化和免疫印跡研究。
　　結(jié)果:1.共鑒定差異蛋白112個，與正常對照組相比，在IPAH組上調(diào)≥1.5倍的蛋白48個，下

4、調(diào)≥1.5倍的蛋白64個。
　　2.蛋白質(zhì)功能富集分析顯示差異表達蛋白質(zhì)參與的主要生物學過程包括對損傷的反應、細胞外結(jié)構(gòu)的組織、炎癥反應、細胞骨架的組織等。蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析顯示，這些蛋白質(zhì)參與的相互作用網(wǎng)絡主要集中在8個網(wǎng)絡模塊:免疫調(diào)節(jié)、對內(nèi)源性物質(zhì)的反應、發(fā)育過程、對生長因子及有機體的反應、細胞外信號調(diào)節(jié)、翻譯蛋白的膜錨定和核膜分解過程等。差異蛋白相互作用主要通路如下:細胞骨架相關(guān)通路、凝血相關(guān)通路、血紅素代謝相關(guān)通路和

5、細胞增殖等。
　　3.蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)IPAH患者肺組織中Transgelin(轉(zhuǎn)凝蛋白)表達顯著高于正常對照組(IPAH/對照=5.105倍，P=0.000)，免疫組化研究顯示Transgelin在特發(fā)性肺動脈高壓患者Transgelin表達明顯升高，且主要表達于肺動脈平滑肌細胞，免疫印跡顯示特發(fā)性肺動脈高壓患者Transgelin表達明顯高于對照組(P=0.017）。
　　結(jié)論本研究采用蛋白質(zhì)組學的技術(shù)，比較了正常對照

6、和IPAH患者肺組織的差異蛋白，共鑒定112個差異蛋白，免疫組化和免疫印跡驗證Transgelin在IPAH患者肺組織中表達上調(diào)，可能與IPAH的發(fā)病機制有關(guān)。
　　第二部分:先天性心臟病相關(guān)性肺動脈高壓肺組織蛋白質(zhì)組學研究
　　目的:肺動脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是先天性體-肺分流性心臟病最常見的并發(fā)癥。大約5％-10％的CHD患者最終發(fā)展為肺動脈高壓，對于已經(jīng)形成PA

7、H，但尚未發(fā)展為艾森曼格綜合癥的先心病患者，在實施手術(shù)干預之前，難以準確判斷肺血管病變的性質(zhì)及是否具有可逆性。隨著蛋白質(zhì)組學理論和技術(shù)的發(fā)展和完善，使人們可以在組織或細胞的蛋白質(zhì)整體表達水平研究疾病。本研究應用iTRAQ多重化學標記-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，觀察分析先心病術(shù)后肺動脈高壓可逆的患者與肺動脈高壓不可逆的患者肺組織中的差異蛋白，在蛋白質(zhì)組學水平探討先心病術(shù)后PAH可逆的分子學機制。
　　方法:入選具有外科修補術(shù)適應證的先心病患者，

8、并于患者接受外科手術(shù)時在手術(shù)中切取肺組織;正常對照組患者在接受胸科手術(shù)時切取正常肺組織作為正常對照組肺組織標本。對進行外科修補術(shù)的先心病患者進行隨訪，于術(shù)后一年復查右心導管，右心導管測定肺動脈平均壓(mPAP)＜25 mmHg者為先心病患者肺動脈高壓可逆組，mPAP≥25 mmHg者為先心病患者肺動脈高壓不可逆組。提取肺組織總蛋白，bradford方法定量。丙酮沉淀蛋白以及胰蛋白酶酶解之后，用iTRAQ試劑標記。用AB SCIEXTri

9、pleTOF5600質(zhì)譜儀檢測差異蛋白，獲得差異蛋白的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖。對鑒定到的差異蛋白進行生物信息學分析，進行蛋白質(zhì)功能富集分析、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析以及蛋白質(zhì)相互作用通路分析。根據(jù)生物信息學結(jié)果和文獻閱讀，選取可能與先心病PAH可逆機制有關(guān)的差異蛋白。
　　結(jié)果:共鑒定差異蛋白160個，與先心病PAH可逆組相比，在先心病PAH不可逆組上調(diào)≥1.5倍的蛋白85個，下調(diào)≥1.5倍的蛋白75個。蛋白質(zhì)功能富集分析顯示差異表

10、達蛋白質(zhì)參與的主要生物學過程包括細胞黏附、生物附著、對損傷反應、細胞內(nèi)吞正調(diào)節(jié)、肌動蛋白絲介導過程、細胞基質(zhì)粘附、細胞骨架組織、肌動蛋白骨架組織、急性炎癥過程、蛋白翻譯過程、血液凝固、穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和參與膽固醇轉(zhuǎn)運。這些蛋白質(zhì)參與的相互作用網(wǎng)絡主要集中在15個網(wǎng)絡模塊，主要是:免疫調(diào)節(jié)、免疫反應信號通路、細胞組分結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、肌肉收縮、正調(diào)節(jié)蛋白代謝、病毒轉(zhuǎn)錄、正調(diào)節(jié)生物過程、補體激活、免疫反應正調(diào)節(jié)和細胞對生長因子的反應等。差異蛋白相互作

11、用主要通路如下:免疫反應的補體通路、細胞黏附與遷移通路、細胞骨架重塑、內(nèi)皮細胞非縫隙鏈接接觸、凝血通路、HDL介導膽固醇反向轉(zhuǎn)運、肺癌中TGF-β通路和整合素信號轉(zhuǎn)導的細胞骨架重塑通路。
　　結(jié)論:本研究對先心病相關(guān)性肺動脈高壓患者的肺組織進行蛋白質(zhì)組學研究，發(fā)現(xiàn)先心病相關(guān)性肺動脈高壓患者術(shù)后PAH不可逆組和PAH可逆組相比，有160種蛋白質(zhì)表達量存在差異，其中在先心病PAH不可逆組中上調(diào)蛋白85個，下調(diào)蛋白75個。生物信息學研究

12、發(fā)現(xiàn)，較多蛋白質(zhì)與細胞骨架重塑和炎癥反應相關(guān)，結(jié)合相關(guān)文獻，篩選出的Caveolin-1、FilaminA以及Apolipoprotein A-I可能與先心病術(shù)后PAH不可逆相關(guān)，需進一步研究證實。
　　第三部分:體重指數(shù)評價特發(fā)性肺動脈高壓患者預后的研究
　　目的:“肥胖矛盾”，是指雖然肥胖與心血管疾病發(fā)病相關(guān)，但體重指數(shù)(body massIndex，BMI)較高的心血管病患者預后較好。尚未有研究關(guān)于體重指數(shù)與特發(fā)性肺動

13、脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者預后關(guān)系的研究。本研究探索研究BMI對IPAH患者預后的作用。
　　方法:對入選的173例特發(fā)性肺動脈高壓患者進行隨訪，以全因死亡為隨訪終點。將人群按國際BMI定義分類，分為低體重組(BMI＜18.5kg/m2)，正常體重組(18.5-24.9kg/m2)，超重和肥胖組（25-34.9 kg/m2）。先比較不同BMI水平人口

14、學特征和各項臨床指標的差異，再應用Kaplan-Meier曲線及Log-rank檢驗對不同BMI人群的生存率進行描述及比較，多因素Cox回歸用于分析BMI對IPAH患者預后的獨立預測作用。
　　結(jié)果:平均隨訪時間隨訪為31個月，其中57例死亡。不同BMI水平組的患者在年齡、心功能分級、左心室舒張末期內(nèi)徑方面存在顯著差異，其中超重肥胖組的年齡較大，心功能分級較好，左心室舒張末期內(nèi)徑較大。三組人群的右心導管測試血流動力學指標及血清NT

15、-proBNP方面無統(tǒng)計學差異。kaplan-meier生存曲線顯示，相對于正常體重組和低體重組，超重和肥胖組有更好的生存率（log-rank檢驗，分別P=0.027，P=0.000）。多元COX回歸分析顯示低體重（P=0.001）、 WHO心功能分級差（P=0.046）、低心臟指數(shù)(P=0.000)、左室舒張末期內(nèi)徑小（P=0.001）、未使用靶向藥物治療（P=0.000）都是預測IPAH患者預后較差的獨立危險因素。
　　結(jié)論:

16、BMI較高的IPAH患者生存率較正常體重和低體重患者好。
　　第四部分:血清乳酸脫氫酶對特發(fā)性肺動脈高壓患者全因死亡風險的預測作用
　　目的:心力衰竭時肝功能損傷是導致血清乳酸脫氫酶(serum lactatedehydrogenase，S-LDH)增高的因素之一，而特發(fā)性肺動脈高壓(idiopathicpulmonary arterial hypertension，IPAH)后期的主要特征是右心衰竭。本研究的目的是探索研究

17、S-LDH對IPAH患者預后的作用。
　　方法:連續(xù)入選2007年5月至2012年7月在阜外醫(yī)院住院的173名IPAH患者，男性48例，女性125例，平均年齡31±10歲。按照S-LDH正常界值(250 IU/L)，分為S-LDH正常組(S-LDH＜250 IU/L)以及S-LDH升高組(S-LDH≥250 IU/L)。對所有入選的患者都進行了右心導管檢查，生化檢查在右心導管檢查的一周內(nèi)進行。
　　結(jié)果:入選的173例IPA

18、H患者中，有53例(30.6％) IPAH患者S-LDH≥250 IU/L，為S-LDH升高組，120例患者S-LDH＜250 IU/L，為S-LDH正常組。兩組在性別、體重指數(shù)、肺毛細血管楔壓、血清肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及靶向藥物治療方面差異無統(tǒng)計學意義。但S-LDH升高組與S-LDH正常組相比，前者心功能分級較差;右心房平均壓、肺動脈平均壓、肺血管阻力、尿酸、總膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶和NT-proBNP較高;心指數(shù)以及混合靜脈血氧飽和度較低

19、。在平均31.2±17.9個月的隨訪時間中，一共57例患者死亡，其中S-LDH正常組中有20例(16.7％)的患者死亡，而S-LDH升高組中有37(69.8％)例患者死亡。kaplan-meier生存曲線顯示S-LDH升高組的預后顯著差于S-LDH正常組（log-rank檢驗，P＜0.001）。在多因素COX生存分析中，低體重指數(shù)（P＜0.001）、低心臟指數(shù)(P＜0.001)、WHO心功能分級差(P=0.030)、高S-LDH（P=0

20、.002）以及缺乏靶向藥物治療(P＜0.001)是IPAH患者死亡的獨立危險因素。ROC曲線進一步顯示S-LDH水平增高預示IPAH患者預后差，最佳的S-LDH預測介值是218.5 IU/l（敏感性，80％;特異性，70％）。曲線下面積0.778[95％可信區(qū)間(CI)，0.701-0.855]，而NT-proBNP的曲線下面積是0.642(95％ CI，0.555-0.730)。
　　結(jié)論:升高的血清乳酸脫氫酶是特發(fā)性肺動脈高壓