分泌型蛋白質(zhì)NBL1在體-肺分流性肺動(dòng)脈高壓中的作用.pdf

1、第一部分:新型單側(cè)高動(dòng)力性肺動(dòng)脈高壓模型的建立
　　 目的:現(xiàn)有大鼠分流模型僅能導(dǎo)致肺血管產(chǎn)生Ⅰ級(jí)病變，而先天性心臟畸形患者肺組織內(nèi)典型的肺血管重構(gòu)改變至今尚未在大鼠分流模型中再現(xiàn)。本研究通過(guò)分期手術(shù)的方法，建立了一種新型單側(cè)肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，以誘導(dǎo)出更為嚴(yán)重的肺血管病變。
　　 方法:經(jīng)右側(cè)肋間如胸腔，結(jié)扎右肺動(dòng)脈，一周后，建立頸部分流。術(shù)后即刻，8周，12周通過(guò)右心導(dǎo)管評(píng)估此模型對(duì)肺血流動(dòng)力學(xué)的即刻和長(zhǎng)期作用。肺組

2、織行HE染色和Weigert's染色來(lái)評(píng)估肺血管系統(tǒng)形態(tài)學(xué)改變情況。同時(shí)做了右室肥厚指數(shù)計(jì)算和血?dú)夥治觥?br>　　 結(jié)果:頸部分流完成瞬間肺循環(huán)即成循環(huán)高壓狀態(tài)，且隨著病程的進(jìn)展，逐步發(fā)展至臨界態(tài)。肺血管病理學(xué)顯示術(shù)后8周出現(xiàn)可逆病變（Ⅰ-Ⅱ級(jí)肺血管病變:中膜肌化，內(nèi)膜增生），術(shù)后12周出現(xiàn)不可逆病變（Ⅲ級(jí)肺血管病變:內(nèi)膜纖維化，血管腔閉塞）。同時(shí)伴有顯著的右心室肥厚和氧分壓的降低。
　　 結(jié)論:此分流模型成功誘導(dǎo)了肺循環(huán)的

3、高壓狀態(tài)，在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)再現(xiàn)了肺血管病變由可逆狀態(tài)向不可逆狀態(tài)的典型轉(zhuǎn)變過(guò)程。因此，本研究可為分流性肺動(dòng)脈高壓潛在機(jī)制的研究提供一個(gè)死亡率低，可重復(fù)強(qiáng)的模型選擇。
　　 第二部分:分泌型蛋白質(zhì)NBL1在體肺分流性肺動(dòng)脈高壓中的作用
　　 背景:正常情況下主要表達(dá)于肺組織，而在體肺分流性肺動(dòng)脈高壓時(shí)發(fā)生特征性改變的蛋白質(zhì)將是先天性心臟病肺動(dòng)脈高壓研究的新靶點(diǎn)。因此，本研究旨在發(fā)現(xiàn)在先天性心臟病性肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展過(guò)程中

4、發(fā)生顯著改變的分泌型蛋白質(zhì)。
　　 方法:對(duì)5例先天性心臟并合并重度肺動(dòng)脈高壓的病人和5例先天性心臟病且肺動(dòng)脈壓力正常的病人外周血進(jìn)行抗體芯片的測(cè)試。篩選出變化顯著的分泌型蛋白質(zhì)，選擇分泌型蛋白質(zhì)NBL1作為進(jìn)一步研究的靶點(diǎn)蛋白。Elisa的方法驗(yàn)證分泌型蛋白質(zhì)NBL1在大樣本的臨床病例中的變化趨勢(shì)及分泌型蛋白質(zhì)NBL1的血漿濃度和肺血流動(dòng)力學(xué)的相關(guān)性;應(yīng)用RT-PCR，Western-blot及組織化學(xué)的方法在我們新近構(gòu)建的大

5、鼠體肺分流模型中進(jìn)一步驗(yàn)證，以明確分泌型蛋白質(zhì)NBL1在肺組織中的分布，表達(dá)情況及在肺動(dòng)脈高壓性肺組織中的變化;在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中驗(yàn)證NBL1的來(lái)源及重組NBL1蛋白對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響;最后在體肺分流模型持續(xù)補(bǔ)充重組蛋白NBL1。
　　 結(jié)果:抗體蛋白芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些分泌型蛋白質(zhì)在先天性心臟病合并肺動(dòng)脈高壓的病人和先天性心臟病無(wú)肺動(dòng)脈高壓的病人間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們選擇NBL1進(jìn)行

6、下一步驗(yàn)證。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)NBL1主要特異性的表達(dá)在正常肺組織且其mRNA水平在體肺分流大鼠模型中呈時(shí)間依賴性的下降;Western-blot分析顯示NBL1在正常肺組織中高表達(dá)且在體肺分流性肺組織中亦呈時(shí)間依賴性的表達(dá)下降;組織化學(xué)顯示NBL1在正常肺組織中高表達(dá)，而在體肺分流性肺組織中低水平表達(dá)。而且，細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞均能分泌NBL1，且這種分泌行為伴隨著細(xì)胞表型和細(xì)胞周期分布的改變，另外NBL1

7、能特異的拮抗BMP2/4對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用。先天性心臟病病人和體肺分流性SD大鼠的外周血Elisa結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿NBL1水平隨著肺動(dòng)脈高壓程度的加重而逐漸降低;而持續(xù)補(bǔ)充重組NBL1蛋白使體肺分流性SD大鼠肺動(dòng)脈壓力進(jìn)一步升高，肺血管重構(gòu)程度進(jìn)一步加重。
　　 結(jié)論:分泌型蛋白質(zhì)NBL1主要高表達(dá)于正常肺組織。體肺分流性肺動(dòng)脈高壓性肺組織中NBL1的表達(dá)水平降低且血漿NBL1濃度和肺動(dòng)脈高壓的程度負(fù)相