Il-18和p100蛋白在鼻息肉形成過程中潛在作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:鼻息肉是鼻腔外側(cè)壁粘膜突入鼻腔形成的新生物，發(fā)病機(jī)制不明，其本質(zhì)是粘膜的慢性持續(xù)性炎癥。白細(xì)胞介素18(IL-18)是近年來發(fā)現(xiàn)的前炎性細(xì)胞因子，在感染、炎癥、自身免疫性疾病、組織的炎性損傷等過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)節(jié)作用。p100蛋白是一種多功能蛋白，它可與多種蛋白轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，廣泛的存在于各種組織細(xì)胞。然而，查閱文獻(xiàn)，未見IL-18和p100蛋白在鼻息肉中的表達(dá)情況的報(bào)道。由此，我們提出疑問:IL-18和p100在鼻息肉中的表達(dá)

2、情況如何呢？二者與鼻息肉的發(fā)病是否有關(guān)系呢？二者在鼻息肉的發(fā)病機(jī)制中到底扮演什么樣的角色呢？其深入的分子機(jī)制又是如何？此課題我們檢測(cè)IL-18和p100在鼻息肉中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探討二者在鼻息肉形成過程中可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 第一部分:IL-18等細(xì)胞因子及p100蛋白在鼻息肉中的表達(dá)與定位。收集鼻息肉和正常鼻粘膜臨床標(biāo)本，將其分為兩部分，一部分制作石蠟病理切片，進(jìn)行HE及免疫組化染色，觀察鼻息肉炎細(xì)

3、胞構(gòu)成及浸潤(rùn)情況，觀察IL-18、p100蛋白在鼻息肉中的表達(dá)情況。另一部分液氮儲(chǔ)存，勻漿并變性蛋白后進(jìn)行WesternBlotting檢測(cè)，在蛋白水平進(jìn)一步的驗(yàn)證IL-18、p100蛋白在鼻息肉中的表達(dá)情況。
　　 第二部分:IL-18在鼻息肉形成過程中可能作用機(jī)制的研究。這部分實(shí)驗(yàn)中，我們以A549細(xì)胞系作為呼吸道上皮細(xì)胞的代表，以炎癥因子LPS，細(xì)胞因子IL-4刺激A549細(xì)胞，觀察IL-18的表達(dá)情況以明確上皮細(xì)胞在炎癥

4、狀態(tài)下是否會(huì)分泌IL-18等細(xì)胞因子以及上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之間是否會(huì)相互調(diào)控，以進(jìn)一步的證明IL-18參與了鼻息肉形成的病理機(jī)制，且上皮細(xì)胞可能是鼻息肉病理機(jī)制發(fā)生的“initiator”。
　　 第三部分:p100在鼻息肉形成過程中可能作用機(jī)制的。在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們將實(shí)驗(yàn)分成兩個(gè)部分，(1) p100是否參與IL-4/STAT6和LPS/TLR4信號(hào)通路的研究;(2) p100是否參與增殖和細(xì)胞周期的研究。在第一部分實(shí)驗(yàn)

5、中我們的技術(shù)路線是:在細(xì)胞水平，以LPS，IL-4刺激A549細(xì)胞，觀察IL-8，IL-6等細(xì)胞因子，STAT6，p100的表達(dá)變化情況。在動(dòng)物水平，我們以O(shè)VA誘導(dǎo)小鼠哮喘模型以模擬IL-4/STAT6信號(hào)通路，以LPS誘導(dǎo)急性肺炎模型模擬LPS/TLR4信號(hào)通路，取小鼠肺組織，觀察支氣管上皮細(xì)胞p100表達(dá)情況。在第二部分實(shí)驗(yàn)中我們又分為兩個(gè)小的實(shí)驗(yàn)①p100與增殖狀態(tài)關(guān)系的初步研究和②p100與細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的關(guān)系

6、的研究，實(shí)驗(yàn)①的技術(shù)路線是取小鼠不同增殖狀態(tài)的組織和不同增殖狀態(tài)的外周血細(xì)胞檢測(cè)p100蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)②的技術(shù)路線是第一，我們培養(yǎng)裂解hela細(xì)胞，分別以p100抗體釣取c-Myc蛋白，以c-Myc抗體釣取p100蛋白，WB檢驗(yàn)釣取結(jié)果，以明確p100蛋白是否與c-Myc蛋白相結(jié)合。第二，以不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞，建造p100過表達(dá)，和p100抑制的細(xì)胞模型，檢測(cè)c-Myc的表達(dá)情況，以視p100表達(dá)是否對(duì)c-Myc蛋白表達(dá)產(chǎn)

7、生影響。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:我們發(fā)現(xiàn)IL-18、IL-4、IFN-γ在正常鼻粘膜及鼻息肉的上皮層、腺體及間質(zhì)的炎性細(xì)胞中均有表達(dá)，且在鼻息肉中表達(dá)增加，在嗜酸粒鼻息肉中表達(dá)增加更明顯，成熟型IL-18僅在鼻息肉中表達(dá)，而正常鼻粘膜中缺如。我們還發(fā)現(xiàn)p100蛋白在鼻息肉上皮層和腺體中也大量表達(dá)，但在80％的嗜酸粒細(xì)胞中表達(dá)缺失。
　　 第二部分:我們證實(shí)IL-18在上皮細(xì)胞系A(chǔ)549中表達(dá)，且在LPS刺

8、激下表達(dá)增加，成熟型IL-18僅在LPS刺激的A549細(xì)胞中表達(dá)，而正常A549中缺如。我們還發(fā)現(xiàn)IL-4能減弱IL-18在上皮細(xì)胞系A(chǔ)549中表達(dá)。細(xì)胞因子在上皮細(xì)胞的表達(dá)也可相互調(diào)控。
　　 第三部分:p100蛋白參與炎癥的機(jī)制可能是參與了IL-4/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而沒有參與LPS/TLR4信號(hào)通路誘導(dǎo)的細(xì)胞因子生成過程。另外，p100蛋白可能與細(xì)胞周期密切相關(guān)，其參與細(xì)胞周期可能不是通過c-Myc途徑，而是通過其它

9、的信號(hào)通路。
　　 結(jié)論:IL-18、p100正常鼻粘膜及鼻息肉中均大量表達(dá)。IL-18在鼻息肉中表達(dá)增加，成熟型IL-18僅在鼻息肉中表達(dá)，而正常鼻粘膜中缺如。IL-18在鼻息肉的形成過程中可能發(fā)揮重要的作用。鼻粘膜上皮細(xì)胞可在致炎因素的刺激下分泌大量的細(xì)胞因子如IL-18、IL-4、IFN-γ等，鼻上皮細(xì)胞是接觸抗原的第一道屏障，可能是鼻息肉等疾病發(fā)生發(fā)展的“initiator”。p100蛋白通過IL-4/STAT6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)