壽胎丸對HLa-G免疫信號通路的影響及機制初步非軍事化.pdf

1、目的：⑴探討壽胎丸不同藥物濃度、不同作用時間對HLA-G各亞型mRNA、蛋白表達的影響。⑵探討壽胎丸不同藥物濃度、不同作用時間對ILT2、KIR2DL4基因mRNA、蛋白表達的影響。⑶探討傳統(tǒng)方劑壽胎丸對母胎界面HLA G配體及其受體KIR2DL4、ILT2介導(dǎo)的信號通路的作用，及其在治療不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)中的作用。⑷探討HLA-G各亞型在不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)中的時序作用。
　　方法：①培養(yǎng)特異性表達HLA-G的JEG-3細胞，及表

2、達ILT2、KIR2DL4受體的NK92細胞。②取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的JEG-3細胞及NK92細胞，分別均勻接種于24孔板，每12小時取4個孔進行計數(shù)，至每孔細胞豐度達100％，以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)目為縱軸繪制生長曲線。③通過MTT細胞增殖與毒性實驗，確定含壽胎丸凍干粉培養(yǎng)基分別作用于JEG-3細胞、NK92細胞的有效作用濃度范圍，制定濃度梯度。④不同濃度梯度含壽胎丸凍干粉培養(yǎng)基作用于JEG-3細胞、NK92細胞，培養(yǎng)60小時，R

3、T-PCR檢測每12小時HLA-G各亞型、ILT2、KIR2DL4基因mRNA表達的情況。⑤不同濃度梯度含壽胎丸凍干粉培養(yǎng)基作用于JEG-3細胞、NK92細胞，用流式細胞術(shù)檢測每12小時膜型全長HLA-G1、ILT2、KIR2DL4蛋白表達的情況。⑥取對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的JEG-3細胞及NK92細胞，按不同數(shù)目比例進行共培養(yǎng)24小時，MTT細胞毒性實驗確定效靶比。⑦數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，采用重復(fù)測量方差分析，得到各基因整

4、體趨勢，及時間因素、濃度因素、交互效應(yīng)對各基因表達的貢獻大小。對數(shù)據(jù)進行拆分，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)多重比較配對t檢驗（Bonferroni法）進行相同濃度各時間點上的兩兩比較;采用多因素方差分析進行相同時間點上不同藥物濃度組間的兩兩比較。
　　結(jié)果：⑴寇式法計算含壽胎丸培養(yǎng)基進行JEG-3細胞培養(yǎng)的IC50濃度為1.884mg/ml， NK92細胞培養(yǎng)的IC50濃度為0.6088mg/ml。⑵不同時間、不同藥物濃度均對HLA-G1 m

5、RNA的表達有影響，且存在交互作用（F=775.340，P=0.000）。3mg/ml對表達起抑制作用，2mg/ml及以下濃度于24h解除抑制后對HLA-G1 mRNA表達起促進作用，以0.5mg/ml組最顯著。以36h為界點，36h前HLA-G1mRNA表達與濃度成正比;36h后HLA-G1mRNA表達與濃度呈反比。⑶不同時間、不同藥物濃度均對HLA-G2 mRNA的表達有影響，且存在交互作用（F=102.692，P=0.000）。0

6、.5mg/ml組與時間成正比，其他濃度組表達水平與時間因素間無依賴性，各濃度組表達最高點均位于60h時。低于3mg/ml藥物濃度于24h短暫抑制后隨時間對HLA-G2mRNA表達具有促進作用，以0.5mg/ml濃度最顯著。⑷不同時間、不同藥物濃度均對HLA-G3 mRNA的表達有影響，且存在交互作用（F=203.727，P=0.000）。各濃度組均在12h時表達水平最低，48h時出現(xiàn)第二個低谷，60h時表達最高，表達水平與時間因素?zé)o依賴

7、關(guān)系。各時間點HLA-G3mRNA的表達均與濃度呈反比。60h表達以0.5mg/ml最高，且0.5mg/ml組各時間點表達水平始終位于對照組水平以上。⑸不同時間、不同藥物濃度均對HLA-G4 mRNA的表達有影響，且存在交互作用(F=197.812，P=0.000)。除0.5mg/ml組與時間成正比外，其他濃度表達水平與時間因素間無依賴性，各濃度組60h時表達水平最高;0.5mg/ml組24h后表達水平均在同時間其他濃度組以上，且各時間

8、點表達均高于對照組。⑹不同時間、不同藥物濃度均對HLA-G5 mRNA的表達有影響，且存在交互作用(F=472.895，P=0.000)。各濃度對HLA-G5mRNA表達24h后均為促進作用，且與時間成正比。⑺不同時間、不同藥物濃度均對HLA-G6 mRNA的表達有影響，且存在交互作用（F=295.869，P=0.000）。2mg/ml、3mg/ml濃度對HLA-G6mRNA表達起促進作用，60h時表達水平最高。1.5mg/ml、0.5

9、mg/ml濃度對HLA-G6mRNA表達起抑制作用。⑻不同時間、不同藥物濃度均對HLA-G7 mRNA的表達有影響，且存在交互作用（F=468.075，P=0.000）。3mg/ml濃度組隨時間積累無明顯促進作用，2mg/ml及以下濃度組隨時間起促進作用。⑼不同時間、不同藥物濃度均對KIR2DL4 mRNA的表達有影響，且存在交互作用（F=326.133，P=0.000）。各濃度組表達水平均與時間因素?zé)o依賴性，24h時表達最低，36h時

10、表達最高;12h、48h、60h各濃度組間無差異，24h、36h表達水平與濃度成反比，0.5mg/ml組各時間點均不低于其他濃度組及對照組。⑽不同時間、不同藥物濃度均對ILT2 mRNA的表達有影響，且存在交互作用（F=1487.783，P=0.000）。表達水平與時間因素?zé)o依賴性。48h、60h各濃度組表達水平相等，其余時間點表達水平與濃度成反比。2mg/ml、1.5mg/ml濃度各時間點均不高于對照組，無顯著促進作用;0.5mg/m

11、l濃度各時間點表達均不低于對照組，具有促進作用。⑾不同時間對HLA-G1蛋白的表達有影響（F=53.102，P=0.000），不同濃度24小時內(nèi)對HLA-G1蛋白表達無影響（F=1.609，P=0.247）。各濃度表達水平與時間因素成反比，12h表達水平高于24h表達水平;12h時表達水平與濃度成正比，24h時表達水平與濃度成反比。24h內(nèi)藥物對HLA-G1蛋白表達無顯著促進作用，0.5mg/ml以上濃度抑制作用明顯。⑿不同時間對ILT

12、2蛋白的表達有影響（F=23.946，P=0.001），不同濃度24小時內(nèi)對ILT2蛋白表達有影響（F=8.894，P=0.002），二者無交互作用(F=1.579，P=0.254)。各濃度表達水平與時間因素成正比，各時間點表達水平均在對照組以上;各時間點表達水平與濃度成反比，表達水平均在對照組以上。⒀壽胎丸在24小時內(nèi)對KIR2DL4蛋白在NK92細胞表面的低表達狀態(tài)無作用(P≥0.423)。⒁以NK92細胞作為效應(yīng)細胞，JEG-3細

13、胞為靶細胞，當(dāng)效靶比為10∶1時殺傷率高達60.40％，效靶比5∶1-1∶1抑制率在50％以下，且無統(tǒng)計學(xué)差異（P≥0.05），后續(xù)實驗選擇1∶1比例進行。
　　結(jié)論：①壽胎丸可促進HLA-G基因7種亞型的表達，且存在濃度效應(yīng)、時間效應(yīng)及相互效應(yīng)。②壽胎丸可促進ILT2、KIR2DL4基因的表達，且存在濃度效應(yīng)、時間效應(yīng)及相互效應(yīng)。③壽胎丸可能通過上調(diào)HLA-G、KIR2DL4、ILT2基因表達，促進NK細胞抑制性信號的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)