三氯乙烯致敏豚鼠體液免疫改變及其與肝損傷的關(guān)系.pdf

1、研究背景：三氯乙烯(TCE)是一種有機(jī)溶劑,在工業(yè)上作為脫脂、清洗和去污劑應(yīng)用廣泛。職業(yè)暴露TCE的工人出現(xiàn)三氯乙烯藥疹樣皮炎(DMLT)伴肝功能損傷已經(jīng)成為國內(nèi)目前主要的職業(yè)衛(wèi)生問題,近幾年關(guān)于皮膚損傷的機(jī)制研究較多,多認(rèn)為是遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。DMLT患者往往伴有嚴(yán)重的肝損傷,繼發(fā)的肝、腎多臟器損傷往往是DMLT患者死亡的直接原因,但是目前關(guān)于肝損傷的機(jī)制研究較少,現(xiàn)有的免疫和遺傳多態(tài)性等機(jī)制不足以解釋DMLT伴發(fā)的肝損傷。近年,國內(nèi)學(xué)

2、者對(duì)DMLT患者進(jìn)行研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫和包括補(bǔ)體(Complement,C)在內(nèi)的免疫性指標(biāo)異常,提示在DMLT患者出現(xiàn)的肝功能損傷發(fā)生過程中除了IV型變態(tài)反應(yīng)參與外,可能還有其他的免疫機(jī)制參與。
　　研究目的：根據(jù)不同組別及時(shí)點(diǎn)豚鼠血清中IgA、IgG、IgM、C3、C4、IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC和IgM/C3-CIC的表達(dá)水平,結(jié)合肝功能檢查、病理學(xué)檢查和超微結(jié)構(gòu)檢查,探討TCE致敏豚鼠體液免疫改

3、變及其與肝損傷的關(guān)系。
　　研究方法：選用體重250~300g/只,白色雌性豚鼠,經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)一星期后,隨機(jī)分成空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(橄欖油)、TCE組。采用豚鼠最大值試驗(yàn)(GuineaPigMaximizationTest,GPMT)方法建立豚鼠致敏模型,觀察并記錄豚鼠背部受試區(qū)的皮膚反應(yīng)情況并進(jìn)行拍照;依據(jù)《化學(xué)品毒性鑒定技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)監(jiān)督發(fā)【2005】272號(hào))中規(guī)定的皮膚反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)豚鼠皮膚反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分;當(dāng)受試樣品組動(dòng)

4、物皮膚反應(yīng)積分≥1時(shí),為皮膚致敏反應(yīng)陽性,該動(dòng)物被劃分為致敏組,反之被劃分為未致敏組。另外在末次激發(fā)前一天隨機(jī)選取5只動(dòng)物作為TCE14d組,采血并處死動(dòng)物,無菌取肝組織。分別在末次激發(fā)后24h和72h分兩批抽取豚鼠血液制備血清,用于檢測(cè)免疫球蛋白IgA、IgG、IgM,肝功能,補(bǔ)體C3、C4和循環(huán)免疫復(fù)合物IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC、IgM/C3-CIC;并處死動(dòng)物,無菌取肝臟,一部分放入20ml10％福爾馬林中固定后

5、,常規(guī)制成切片進(jìn)行病理學(xué)檢查;另一部分肝臟用0.1mol/l戊二醛-多聚甲醛混合緩沖固定液(Karno)固定8~10h后,用系列乙醇脫水,最后用環(huán)氧樹脂(EPON812)包埋,制成超薄切片,用透射電子顯微鏡(TEM)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)并攝片;用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　1.致敏率在皮膚致敏反應(yīng)試驗(yàn)中,空白組、溶劑對(duì)照組和TCE14d組均未見紅斑或水腫,在TCE試驗(yàn)組的26只動(dòng)物中有17

6、只出現(xiàn)紅斑水腫,致敏率為65.38%。
　　2.IgA檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgA水平均明顯降低(p<0.05)。TCE14d組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。在激發(fā)后24h和72h時(shí)點(diǎn),TCE致敏組與未致敏組相比,血清中IgA水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏組和TCE未

7、致敏組的血清中IgA水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與TCE致敏24h組相比,TCE致敏72h組的血清中IgA水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　3.IgG檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgG水平均降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。TCE14d組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。在

8、激發(fā)后24h和72h時(shí)點(diǎn),TCE致敏組與未致敏組相比,血清中IgG水平降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏組24h和72h兩個(gè)時(shí)點(diǎn)的血清中IgG水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　4.IgM檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgM水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。TCE14d

9、組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏24h、72h組和TCE未致敏72h組的血清中IgM水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。5.C3檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏24h、72h組和TCE未致敏72h組的水平均明顯降低(p<0.05)。TCE14d組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。在激發(fā)后72

10、h時(shí)點(diǎn),TCE致敏組與未致敏組相比,血清中C3水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與TCE致敏24h組相比,TCE致敏72h組的水平明顯降低(p<0.05)。
　　6.C4檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中C4水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義(p<0.05)。TCE14d組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中C4水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與TCE致敏24h組相比,TCE致敏72h組的血清中C4水平略有降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　7.IgA/C3-CIC檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組和

12、TCE未致敏組的血清中IgA/C3-CIC水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。TCE14d組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgA/C3-CIC水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與TCE致敏24h組相比,TCE致敏72h組血清中IgA/C3-CIC水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　8.IgG/C3-CIC

13、檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgG/C3-CIC水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。TCE14d組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgG/C3-CIC水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　9.IgM/C3-CIC檢測(cè)結(jié)果溶劑對(duì)照組與

14、空白組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);與溶劑對(duì)照組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgM/C3-CIC水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。TCE14d組與溶劑對(duì)照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。與TCE14d組相比,TCE致敏組和TCE未致敏組的血清中IgM/C3-CIC水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　10.肝功能檢查結(jié)果溶劑對(duì)照組肝功能各指標(biāo)與空白組相比,差異無統(tǒng)

15、計(jì)學(xué)意義(p>0.05);TCE致敏組ALT水平與溶劑對(duì)照組相比升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);而TCE未致敏組ALT水平與溶劑對(duì)照組相比有升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05);TCE致敏動(dòng)物末次激發(fā)后72h動(dòng)物的ALT和AST水平比激發(fā)后24h的明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);在72h的時(shí)點(diǎn),致敏組比未致敏組ALT和AST水平也明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);TCE致敏72h組ALB水平比溶劑對(duì)照組

16、、TCE14d組和TCE未致敏72h組降低(p<0.05)。
　　11.病理學(xué)檢查結(jié)果空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組豚鼠肝細(xì)胞排列整齊,胞質(zhì)均勻,胞核大而圓,核仁明顯,核膜清晰;TCE未致敏組有一部分豚鼠肝臟能見到肝細(xì)胞水腫;TCE致敏組幾乎所有動(dòng)物都有肝細(xì)胞的水腫,但末次激發(fā)后24h水腫程度輕微,而末次激發(fā)后72h動(dòng)物能見到較多大量肝細(xì)胞水腫,并有胞核破裂消失。
　　12.超微結(jié)構(gòu)檢查結(jié)果空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組肝臟結(jié)構(gòu)未見明顯異常

17、;TCE未致敏組可見少數(shù)線粒體空泡、變性,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少;TCE致敏組肝臟細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少、空泡、變性,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂、擴(kuò)張,糖原顆粒明顯減少,且在末次激發(fā)后72h組比24h組的損害更嚴(yán)重。
　　13.血清中C3與循環(huán)免疫復(fù)合物以及肝功能與補(bǔ)體、循環(huán)免疫復(fù)合物之間相關(guān)性分析C3與IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC、IgM/C3-CIC存在顯著正相關(guān);ALT、AST與C3、C4、IgA/C3-CIC、IgG/C3-CIC