補(bǔ)體C3、C3a受體在三氯乙烯致敏小鼠免疫性腎損傷中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　三氯乙烯(Trichloroethylene, TCE)，作為一種常見金屬洗滌劑、脂類萃取劑、涂料稀釋劑廣泛應(yīng)用于電子、電鍍、制藥等行業(yè)。TCE可以引起職業(yè)接觸人群發(fā)生職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎（Occupational Dermatitis Medicamentosa-like of Trichloroethylene, ODMLT）。ODMLT可出現(xiàn)多系統(tǒng)、多臟器的損傷，其中部分患者可出現(xiàn)嚴(yán)重的腎臟損傷，嚴(yán)重威脅

2、相關(guān)職業(yè)人群健康狀況。對于ODMLT發(fā)病機(jī)制，目前研究發(fā)現(xiàn)除了遲發(fā)型IV型變態(tài)反應(yīng)以外，補(bǔ)體系統(tǒng)在發(fā)病過程中可能也起到了重要的作用。在前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)腎臟損傷中存在著補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，補(bǔ)體C3a在致敏小鼠腎臟組織中有明顯的沉積現(xiàn)象。C3a可與其特異性受體C3aR相結(jié)合，發(fā)揮擴(kuò)張血管、趨化炎癥細(xì)胞、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等功能。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)C3a-C3aR系統(tǒng)在多種腎臟損傷中起到了十分重要作用，故深入研究補(bǔ)體系統(tǒng)在TCE致敏小鼠腎臟損傷中的

3、作用對探討ODMLT發(fā)病機(jī)制有著十分積極的意義。
　　研究目的：
　　本研究通過檢測小鼠腎臟中C3及C3aR的表達(dá)，使用C3aR特異性拮抗劑C3aRA（SB290157），來檢測其對TCE致敏小鼠腎臟損傷的影響，揭示補(bǔ)體系統(tǒng)在TCE致敏小鼠免疫性腎損傷中的作用，進(jìn)一步為探索職業(yè)性三氯乙烯藥疹樣皮炎（ODMLT）腎臟損傷機(jī)制提供依據(jù)。
　　研究方法：
　　選取42只無特定病原體（SPF）級(jí)，雌性6-8周 BALB/

4、c小鼠，體重范圍17.1-24.7（20.3?1.7）g。在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，根據(jù)隨機(jī)分配原則將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為：空白對照組（5只）、溶劑對照組（5只）、TCE處理組（16只）和TCE+C3aRA聯(lián)合處理組（16只）。參照BALB/c小鼠三氯乙烯致敏模型方法，在末次激發(fā)24h后，根據(jù)小鼠皮膚反應(yīng)狀況，按照皮膚致敏試驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，當(dāng)小鼠積分≥1分時(shí)，認(rèn)為皮膚致敏陽性即分為致敏組，否則即判定為非致敏組，以此將處理組區(qū)分為致敏組和非致敏

5、組。予末次激發(fā)后第3天，眼球采血及無菌取出腎臟組織，使用腎臟組織制備石蠟切片和冰凍切片。采用肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）檢測試劑盒，檢測血清中腎功能相關(guān)指標(biāo)CRE、BUN的水平；腎臟HE染色來觀察腎臟病理變化狀況；免疫組化檢測腎臟組織中相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平；實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測腎臟組織中C3、C3aR及炎癥因子的逆轉(zhuǎn)錄水平；免疫熒光檢測腎臟組織中足細(xì)胞蛋白Podocin的表達(dá)；Western Blotting檢測腎臟組織中

6、C3aR、Podocin蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　（1）致敏情況：試驗(yàn)期間小鼠生長正常，各組間小鼠體重改變無明顯差異。空白對照組和溶劑對照組小鼠皮膚未見明顯變化，根據(jù)皮膚反應(yīng)情況，TCE處理組致敏率7/16（43.75％），TCE+C3aRA處理組致敏率6/16（37.5％）。
　?。?）腎臟病理結(jié)果顯示：在空白對照組、溶劑對照組和所有非致敏組小鼠腎臟中未發(fā)現(xiàn)明顯的病理改變。TCE致敏組腎臟中可見明顯的炎性細(xì)胞

7、浸潤，腎小管結(jié)構(gòu)改變，腎小管上皮細(xì)胞溶解現(xiàn)象。在C3aRA處理后致敏小鼠腎臟炎性細(xì)胞浸潤明顯減少、腎小管損傷減輕，腎臟損傷得到明顯改善。
　?。?）腎功能檢測結(jié)果：溶劑對照組與各非致敏組之間CRE、BUN水平均未發(fā)現(xiàn)明顯差異，TCE致敏組和TCE+C3aRA致敏組CRE、BUN均高于溶劑對照組和相應(yīng)的非致敏組。但是，發(fā)現(xiàn)在C3aRA處理后，TCE+C3aRA致敏組CRE、BUN水平均明顯低于TCE致敏組。
　?。?）腎臟組織

8、中C3aR測定結(jié)果：與空白對照組和溶劑對照組相比，TCE非致敏組C3aR在轉(zhuǎn)錄水平上均未見明顯變化。與溶劑對照組和相應(yīng)未致敏組比較，TCE致敏組小鼠腎臟組織中C3aR在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上升。Western Blotting結(jié)果也顯示，空白對照組和溶劑對照組以及TCE非致敏組中C3aR蛋白的表達(dá)量較低，但是在TCE致敏組中C3aR蛋白的表達(dá)明顯上升。
　?。?）腎臟組織中C3測定結(jié)果：與空白對照組和溶劑對照組相比，TCE非致敏組在C3

9、轉(zhuǎn)錄水平上未見明顯變化，TCE致敏組腎臟組織中C3在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上升。
　?。?）腎臟組織中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α測定結(jié)果：空白對照組和溶劑對照組與各非致敏組之間腎臟組織中IL-1β、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，TCE致敏組和TCE+C3aRA致敏組腎臟組織中IL-1β、TNF-α均高于溶劑對照組和相應(yīng)非致敏組。但是發(fā)現(xiàn)在C3aRA處理后，TCE+C3aRA致敏組腎臟組織中IL-1β、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平明顯低于T

10、CE致敏組。免疫組化也呈現(xiàn)相同的結(jié)果，在空白對照組和溶劑對照組中均未發(fā)現(xiàn)有IL-1β、TNF-α的明顯表達(dá)，而在TCE致敏組和TCE+C3aRA致敏組腎臟組織中有明顯的表達(dá)，且 TCE+C3aRA致敏組 IL-1β、TNF-α較的表達(dá)水平有所下降。
　?。?）腎臟組織中足細(xì)胞 Podocin蛋白測定結(jié)果：在空白對照組和溶劑對照組中Podocin蛋白可見正常表達(dá)，與空白對照組和溶劑對照組相比 TCE致敏組和TCE+C3aRA致敏組小

11、鼠腎臟Podocin蛋白的表達(dá)明顯降低，但是與TCE致敏組相比，TCE+C3aRA致敏組Podocin蛋白表達(dá)水平有明顯回升。Western Blotting結(jié)果也顯示，與TCE致敏組相比，TCE+C3aRA致敏組與Podocin蛋白表達(dá)水平有明顯回升。
　　結(jié)論：
　?。?）TCE致敏小鼠腎臟中補(bǔ)體C3和C3aR表達(dá)明顯上調(diào)，TCE致敏小鼠腎臟損傷中存在局部補(bǔ)體激活的現(xiàn)象。（2）補(bǔ)體C3aR信號(hào)通過上調(diào)炎癥因子IL-1β和