Smad4基因在HO-8910和HO-8910PM中的表達(dá)及其對腫瘤轉(zhuǎn)移作用的研究.pdf

1、目的：惡性腫瘤是當(dāng)今世界上嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的多臟器功能衰竭是患者死亡的主要原因。隨著腫瘤轉(zhuǎn)移基因調(diào)控下的多階段、多因素、多步驟理論的不斷完善，人們對于腫瘤轉(zhuǎn)移這一極為復(fù)雜的病理過程有了更進(jìn)一步的認(rèn)識。發(fā)現(xiàn)并證實與腫瘤轉(zhuǎn)移過程高度相關(guān)的基因已成為腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究領(lǐng)域的熱點，因為這些基因可以使我們更深入的了解腫瘤轉(zhuǎn)移的機理，同時，這些基因及其產(chǎn)物，有可能成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的靶點或觀察腫瘤患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)。

2、 轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)可以抑制上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞，以及某些腫瘤細(xì)胞的生長<'[1，2]>：也可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、前列腺上皮細(xì)胞等發(fā)生凋亡<'[3-5]>。TGF-β與其效應(yīng)細(xì)胞表面的Ⅱ型受體TβR Ⅱ和Ⅰ型受體TβR Ⅰ形成的異源二聚體結(jié)合，相繼激活TβR Ⅱ和TβR Ⅰ，活化的TβR Ⅰ再進(jìn)一步活化Smad2和Smad3，磷酸化的Smad2/3必須與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，才能進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)靶基因的

3、轉(zhuǎn)錄<'[6]>。Smad4是TGF-β信號通路上一個中樞性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。目前，對TGF-β/Smad信號通路的研究主要集中在胰腺癌等胃腸道腫瘤和血液腫瘤上，對卵巢癌的研究報道較少。卵巢癌是女性生殖器三大惡性腫瘤之一，至今缺乏有效的早期診斷方法，病人就診時多是中晚期，卵巢癌具有癌細(xì)胞從癌體脫落，進(jìn)入腹水，繼而在腹膜、網(wǎng)膜、腸漿膜表面廣泛種植等特點。研究表明，Smad4的過表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成并誘導(dǎo)凋亡。近年證實

4、，Smad4的表達(dá)水平與一些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、生物學(xué)行為及其預(yù)后有密切關(guān)系。不少學(xué)者認(rèn)為Smad4的失活發(fā)生在腫瘤進(jìn)展的后期，屬于晚期分子事件，并與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 我們利用高低轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910和He-8910PM細(xì)胞株作為對象，研究Smad4蛋白在這兩種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的差異，并通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)Smad，檢測TGF-β/Smad信號通路下游靶基因PAI-1、VEGF的表達(dá)，同時檢測了另一個轉(zhuǎn)移

5、相關(guān)基因E-鈣粘附蛋白的表達(dá)，應(yīng)用Transwelldx室法及細(xì)胞劃痕實驗測定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲遷移能力，探討Smad4基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其分子機制。 方法：1、檢測Smad4基因在HO-89l on HO-8910PM細(xì)胞系中的表達(dá)：①通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測Smad4的細(xì)胞定位。②通過Western blot方法檢測Smad4蛋白在He-8910和He-8910PM細(xì)胞系中表達(dá)的差異。2、構(gòu)建Smad4真核表達(dá)載體，脂質(zhì)體

6、法瞬時轉(zhuǎn)染Smad4基因，轉(zhuǎn)染后48小時Western blot方法檢測Smad4、PAI-1、VEGF、E-cadherin的表達(dá)。3、Transwelldx室檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力的差。4、劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移能力差異。5、粘附實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞與基底膜粘附力的差異。6、明膠酶譜法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞上清中MMP2、MMP9的表達(dá)及活性。 結(jié)果：1、免疫細(xì)胞化學(xué)方法分析顯示Smad4基因在細(xì)胞核/質(zhì)表達(dá)，且在HO-8

7、910中高表達(dá)，在HO-8910PM中極低表達(dá)。2、Western blot檢測Smad4基因在HO-8910中高表達(dá)，而在HO-8910PM中低表達(dá)。3、瞬時轉(zhuǎn)染Smad4基因可以下調(diào)PAI-1、上調(diào)E-eadherin的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染前后VEGF表達(dá)無明顯差異。4、Transwell實驗結(jié)果表明PM/Smad4細(xì)胞穿透Matrigel膜細(xì)胞數(shù)較未轉(zhuǎn)染組明顯減少(P<0.05)。5、細(xì)胞遷移實驗結(jié)果表明PM/Smad4遷移速度明顯低于未

8、轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.05)。6、粘附實驗結(jié)果表明PM/Smad4細(xì)胞粘附于基底膜的數(shù)量明顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.05)。7、HO-8910、HO-8910PM、PM/Smad4細(xì)胞上清中MMP2、MMP9的表達(dá)及活性除MMP2前體型無明顯差異。 結(jié)論：1、Smad4基因在HO-8910中高表達(dá)，在HO-8910PM中低表達(dá)，表明Smad4基因與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。2、Smad4可以抑制HO-8910PM細(xì)胞體外侵襲能力，其對侵襲能力的