PtIAA1和PtABP1基因的克隆及其在楊樹中的表達.pdf

1、木材形成是一個受到基因編碼嚴格調控的復雜的生物學過程。若通過分子育種技術來改良木材品質，需首先深入了解木材形成過程的分子機制，即研究控制木材形成的關鍵基因及其相互作用機制，以實現(xiàn)有目的地進行分子育種設計，最終達到調控木材形成、改良木材品質的目的。生長素在形成層活動和維管組織分化中起著極其重要的調控作用，包括：控制形成層活動周期，維持紡錘狀細胞的形態(tài)和排列方向，控制木質部和韌皮部的分化。先前在模式植物擬南芥中的研究初步表明，生長素結合蛋白

2、(AuxinBindingProtein，ABP)和生長素響應蛋白(AuxinResponseProtein，ARP)可通過調控生長素的轉運來實現(xiàn)有效控制木材維管系統(tǒng)發(fā)育和分化。為了研究在木本植物中生長素與形成層活動和次生維管組織形成的關系，本研究利用RT-PCR方法，克隆了2個與生長素信號轉導密切相關的基因，通過組織特異性表達分析和基因工程技術來研究這2個基因在楊樹中的表達模式，初步揭示了其對形成層活動和次生維管組織的影響。得到如下主

3、要結論： 1.Aux/IAA基因在生長素信號轉導系統(tǒng)中具有重要作用。利用RT-PCR方法，首次從毛白楊形成層cDNA中分離出PtIAA1cDNA，并進行了測序和序列分析。結果表明，克隆的毛白楊PtIAA1cDNA片段總長為764bp，基因內部含有完整的開放閱讀框架，大小為606bp，可編碼長度為201個氨基酸殘基的蛋白質。在此基礎上，利用RT-PCR方法，研究了其組織特異表達模式，發(fā)現(xiàn)該基因在形成層區(qū)域表達量最高，未成熟木質部次

4、之，成熟木質部較低，在根部表達豐度很低，而在韌皮部中則幾乎沒有檢測到PtIAA1基因的表達。為了研究PtIAA1基因對形成層活動和次生維管組織形成的影響，以pBI121為載體，分別構建了該基因的正、反義表達載體，通過農桿菌介導的葉盤法，將構建好的基因導入楊樹中，經PCR檢測和Southern雜交實驗表明，本研究得到了該基因的正、反義楊樹轉化植株。定量PCR檢測顯示，該基因在轉化和野生型植株中表達有明顯差異。在此基礎上，通過表型觀察，發(fā)現(xiàn)

5、PtIAA1正義轉化植株的高生長明顯低于對照植株，且地徑小于對照植株。相反PtIAA1反義轉化植株的地徑明顯大于對照植株，而且莖發(fā)生嚴重彎曲。對楊樹莖橫切面進行切片觀察發(fā)現(xiàn)，PtIAA1反義轉化植株形成層區(qū)域明顯變寬，而正義轉基因植株則變窄，初步表明PtIAA1可能參與了形成層細胞的分裂和分化。 2.ABP1是可能的生長素受體，在植物生長發(fā)育過程中有著重要的作用。本研究利用RT-PCR方法，首次從毛白楊形成層cDNA中分離出Pt

6、ABP1cDNA序列，并進行了測序和序列分析。結果表明，克隆的毛白楊PtABP1cDNA片段總長度為699bp，基因內部含有完整的開放閱讀框架，大小為585bp，可編碼長度為194個氨基酸殘基的蛋白質。依據序列分析結果，在編碼區(qū)設計序列特異的引物，通過原位雜交和原位RT-PCR研究其組織表達情況，結果顯示PtABP1主要在形成層區(qū)域表達，而韌皮部、木質部表達水平非常低。為了研究PtABP1在木本植物中的表達模式，以pBI121為載體，構

7、建了該基因的正義表達載體，通過農桿菌介導的葉盤法，將構建好的基因導入楊樹中，經PCR檢測和Southern雜交實驗表明，得到了該基因的轉化植株。定量PCR檢測顯示，該基因在轉化和野生型植株中表達有明顯差異。表型觀察和解剖結構分析表明，與對照相比，沒有發(fā)現(xiàn)轉基因植株有明顯的表型差異，但在解剖結構上顯示，轉基因楊樹木質部纖維細胞的直徑明顯加大，而細胞壁明顯變薄。方差分析結果顯示，轉基因楊樹和對照植株木質部纖維細胞的細胞直徑和細胞壁厚度均達到