小鼠心肌肥厚或心衰中心肌橫管結(jié)構(gòu)及其相關(guān)蛋白JP-2和Cav-3表達(dá)水平的變化.pdf

1、目的：
　　應(yīng)用胸主動(dòng)脈縮窄(TAB)手術(shù)建立小鼠心肌肥厚或心肌衰竭(簡稱:心衰)模型,以此模型為基礎(chǔ),我們致力于研究心肌疾病中橫管的結(jié)構(gòu)是否改變,以及探索橫管結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白junctophilin-2(JP-2)和caveolin-3(Cav-3)水平的變化。
　　方法：
　　1.小鼠分組及模型建立雄性約8周的C57BL/6小鼠,體重20-25 g,清潔級(jí)。手術(shù)前隨機(jī)將動(dòng)物分假手術(shù)對照組(n=6)和手術(shù)組(n=12),

2、將做手術(shù)的小鼠氯胺酮/甲苯噻嗪(劑量分別是40mg/kg和5mg/kg)腹腔注射麻醉,用鑷子將一段3/0的手術(shù)線放置于主動(dòng)脈下。在頭臂動(dòng)脈和左頸動(dòng)脈分支之間的主動(dòng)脈上放入27號(hào)針頭,絲線繞過主動(dòng)脈和針頭打結(jié),然后移走針頭,這樣就把主動(dòng)脈內(nèi)徑固定為針頭的直徑大小。假手術(shù)對照組僅觀察主動(dòng)脈,但不結(jié)扎。
　　2.心臟超聲手術(shù)后5周利用Sonos5500給小鼠做心臟超聲,氯胺酮鹽酸(25 mg/kg)皮下注射使所有存活小鼠處于鎮(zhèn)靜狀態(tài),通

3、過8 MHz的扇形探頭在左心室的長軸和短軸得到高分辨率的二維圖像,每秒可產(chǎn)生1000張圖。根據(jù)心臟超聲資料將手術(shù)組分為心肌肥厚組和心衰組。
　　3.體外整體心臟外膜心肌細(xì)胞橫管的共聚焦成像完整的小鼠心臟室溫下langendorf灌流含有2.5μM的脂溶性的膜結(jié)構(gòu)熒光指示劑FM4-64的無鈣臺(tái)式液20-30分鐘,之后將心臟置于激光共聚焦顯微鏡的灌流腔內(nèi),同時(shí)灌流無FM4-64的無鈣臺(tái)式液。分別在左右心室的自由壁的不同部位采集10-1

4、5張圖片,圖片的平均冪頻譜代表每個(gè)心室的橫管結(jié)構(gòu)。
　　4.Western blot冰上收集小鼠左心室,-80℃保存。利用心臟裂解液提取左心室全蛋白,利用BCA法測蛋白濃度。取樣本于10％十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,蛋白恒流濕轉(zhuǎn)入PVDF膜上,5%新鮮脫脂牛奶室溫封閉1 h,孵一抗4℃過夜,0.1%PBS-T洗膜3×15 min,室溫共同孵育二抗和HRP-GAPDH抗體1.5 h,0.1%PBST洗膜3×15 min,暗

5、室中ECL顯色后曝光。利用image J軟件分析蛋白條帶。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示,兩組均數(shù)之間比較用非配對t檢驗(yàn),三組均數(shù)的比較采用Origin軟件做方差分析。P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1.心臟超聲結(jié)果小鼠大約在TAB手術(shù)后5周形成心肌肥厚或心衰,心肌肥厚的小鼠與假手術(shù)對照組相比在心臟重量、心重與體重的比值和左室重量均有顯著性的增加,但是肺重,舒張末期容積和射血分?jǐn)?shù)沒有

6、明顯的改變。心衰組的小鼠不僅心臟重量、心重與體重的比值和左室重量變化更顯著,而且肺的重量和舒張末期容積明顯增加,射血分?jǐn)?shù)顯著性的下降。
　　2.整體心臟的離體橫管成像在左心室,橫管結(jié)構(gòu)的紊亂開始于心肌肥厚階段,心衰小鼠的橫管遭到更嚴(yán)重的破壞。同樣橫管的冪頻譜的左移趨勢也起于心肌肥厚階段。然而,右心室和左心室不同,只是在心衰的小鼠發(fā)現(xiàn)橫管結(jié)構(gòu)的改變和橫管的冪頻譜左移。
　　3.Western blot與假手術(shù)對照組比較,心肌肥