小鼠心肌肥厚、心衰發(fā)展過程中電生理重構(gòu)及其機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥厚、心衰是高血壓、缺血性心肌病、心瓣膜病等許多心血管疾病的常見合并癥，心肌肥厚、心衰常常伴發(fā)心律失常，特別是心衰期心源性猝死(SCD)的發(fā)生率大大增加。近年來，盡管在心衰的藥物治療上已取得很大的進(jìn)展，但心衰病人的死亡率仍然較高。故揭示心肌肥厚、心衰病理過程中心律失常產(chǎn)生的分子機(jī)制，尋找有效的防治措施，是心血管領(lǐng)域研究的重要課題。 心肌動(dòng)作電位時(shí)程取決于去極化和復(fù)極化電流相互之間精細(xì)的平衡，任何內(nèi)向電流的增加或/和外向電流的

2、減少均可使其延長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)表明，L-型Ca電流(I<,Ca-L>)的變化依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類和心衰進(jìn)展的程度報(bào)道結(jié)果不一，而瞬時(shí)外向鉀電流I<,t0>的下調(diào)則似是較為普遍的現(xiàn)象。已在不同原因所致的多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(包括狗、兔、大鼠、貓等)心肌肥厚、心衰模型及心衰的人心室細(xì)胞上觀察到I<,t0>的減小。故對(duì)I<,t0>。在心肌肥厚、心衰病理狀況下的變化成為目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。然而，小鼠作為目前電生理研究常用的模型動(dòng)物，心肌肥厚、心衰時(shí)對(duì)I<,t0>

3、有限的幾篇報(bào)道結(jié)果卻極不一致。除I<,t0>外，參與心室復(fù)極化的電壓依賴性K<'+>電流尚有I<,K,slow>和I<,ss>，在病理情況下I<,K,slow>和I<,ss>的改變卻報(bào)道很少。另外，心肌肥厚、心衰時(shí)K<'+>電流改變的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路尚不清楚。 本實(shí)驗(yàn)擬在小鼠心肌肥厚、心衰模型上，采用膜片鉗技術(shù)，觀察不同病理發(fā)展階段小鼠心室肌內(nèi)膜下、外膜下心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、L-型鈣電流(I<,Ca-L>)、電壓依賴性K<'+>

4、電流I<,t0>、I<,K,slow>及I<,ss>隨時(shí)間變化的特點(diǎn)，并通過應(yīng)用calcineurin的特異性抑制劑環(huán)孢素A(CsA)，探討K<'+>電流病理性改變可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，為揭示心肌肥厚、心衰的電生理重構(gòu)特征及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分心肌肥厚和心衰不同時(shí)期小鼠左心室跨壁動(dòng)作電位的變化 目的：觀察了小鼠由健康正常狀態(tài)逐漸向心肌肥厚、心衰轉(zhuǎn)變過程中，左室游離壁心內(nèi)膜下、心外膜下細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程及跨壁異

5、質(zhì)性的變化，為揭示心律失常產(chǎn)生的細(xì)胞機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：(1)動(dòng)物模型制備：將小鼠深麻醉后開胸，暴露主動(dòng)脈弓，部分分離：用外徑0.4mm針頭與主動(dòng)脈弓平行結(jié)扎，抽出針頭，使主動(dòng)脈弓狹窄65％-70％。術(shù)后左心室后負(fù)荷增加，血液流出受阻，造成壓力超負(fù)荷性心肌肥厚和心衰的動(dòng)物模型；觀察動(dòng)物的一般狀況并測(cè)定心指數(shù)和血流動(dòng)力學(xué)各參數(shù)(LVSP、±dp/dt)。(2)酶解法分離小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞：取下酶解好的心臟，將左

6、室游離壁的心底和心尖部去掉，用眼科剪平行于左室游離壁中間部分分別剪取心內(nèi)膜下心肌(0.5mm左右)和心外膜下心肌(0.5mm左右)，分別放在KB液中輕柔吹打，用200目篩網(wǎng)過濾，獲得的細(xì)胞在室溫(23℃～25℃)下靜置2 h后備用。(3)采用打孔式膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞動(dòng)作電位，靜息膜電位在-65 mV以上的細(xì)胞予以波寬10 ms，1Hz的方波，100％～120％閾電流誘導(dǎo)動(dòng)作電位，計(jì)算出APD，包括動(dòng)作電位復(fù)極達(dá)50％的時(shí)程(APD<,

7、50>)、動(dòng)作電位復(fù)極達(dá)90％的時(shí)程(APD<,90>)。在電壓鉗下以鉗制電壓為-40 mV，超級(jí)化-20 mV得到的細(xì)胞電容電流積分值，計(jì)算出細(xì)胞電容。 結(jié)論：(1)在心肌肥厚的早期階段(2周) 即出現(xiàn) AP 的延長(zhǎng)，肥厚期外膜延長(zhǎng)超過內(nèi)膜，使跨壁復(fù)極梯度消失。(2)心衰期主要的變化是內(nèi)膜 AP 的延長(zhǎng)，造成內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞復(fù)極離散度增大。即內(nèi)、外膜下細(xì)胞生理跨壁復(fù)極梯度的消失或增大分別構(gòu)成了肥厚、心衰兩個(gè)階段心律失常產(chǎn)生的

8、細(xì)胞基礎(chǔ)。 第二部分心肌肥厚和心衰不同時(shí)期小鼠左心室跨壁L-型鈣電流的變化 目的：觀察心肌肥厚、心衰時(shí)內(nèi)膜下和外膜下心肌細(xì)胞L-型鈣電流(L<,Ca-L>)的變化。 方法：利用小鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥厚、心衰模型，在術(shù)后5周(Band5w，心肌肥厚)和13周(Band 13w，心力衰竭)兩時(shí)間點(diǎn)，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄了左室游離壁內(nèi)膜下細(xì)胞(Endo)和外膜下細(xì)胞(Epi)的I<,Ca-L>及其動(dòng)力學(xué)改變。

9、 結(jié)論：(1)生理狀態(tài)下小鼠左心室內(nèi)、外膜下細(xì)胞I<,Ca-L>密度不存在明顯差別，提示，I<,Ca-L>與APD跨壁異質(zhì)性的產(chǎn)生無關(guān)；(2)心肌肥厚時(shí)內(nèi)膜下細(xì)胞I<,Ca-L>減少，而外膜下細(xì)胞沒有改變，I<,Ca-L>這種非同步的變化可能是此期AP跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)。(3)同樣，心衰時(shí)內(nèi)膜下細(xì)胞I<,Ca-L>密度明顯減少，而外膜下細(xì)胞I<,Ca-L>密度無明顯改變，這種I<,Ca-L>的非同步變化在此期可起到對(duì)抗內(nèi)膜APD延

10、長(zhǎng)，減少?gòu)?fù)極離散度的有益作用。即內(nèi)、外膜下細(xì)胞I<,Ca-L>非同步性改變，可能在肥厚、心衰兩個(gè)不同時(shí)期有著不同的作用。 第三部分心肌肥厚、心衰不同時(shí)期左心室跨壁電壓依賴性鉀電流的變化 目的：觀察術(shù)后5周、13周(分別代表肥厚、心衰兩個(gè)時(shí)期)左室游離壁內(nèi)、外膜下細(xì)胞電壓依賴性鉀電流I<,to>、I<,K,slow>及I<,ss>的變化及其動(dòng)力學(xué)改變，試圖揭示心肌肥厚、心衰不同時(shí)期AP跨壁異質(zhì)性改變的離子基礎(chǔ)。 方

11、法：利用小鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥厚、心衰模型，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察了心肌肥厚(Band 5w)、心衰(Band 13w)小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞電壓依賴性鉀電流I<,t0>、I<,K,slow>及I<,ss>跨壁異質(zhì)性的變化。各種電壓刺激下得到電流的衰減相使用雙指數(shù)擬和區(qū)分出三種電流成分I<,to>、I<,K,slow>、I<,ss>及其失活常數(shù)(τ<,decay>)τ<,1>和τ<,2>，并觀察了病理狀況下通道的動(dòng)力學(xué)特征

12、。 結(jié)論：(1)生理狀態(tài)下小鼠左心室內(nèi)、外膜下細(xì)胞I<,t0>密度存在明顯的差別，即外膜高于內(nèi)膜，這可能是AP生理跨壁梯度形成的主要離子基礎(chǔ)。I<,K,slow>和I<,ss>密度不存在內(nèi)、外膜下細(xì)胞的差別。(2)心肌肥厚階段即存在顯著的各種電壓依賴性K<'+>電流的下調(diào)，是動(dòng)作電位延長(zhǎng)的離子基礎(chǔ)。I<,t0>、I<,ss>在內(nèi)、外膜下細(xì)胞呈同步減少，I<,K,slow>只是在內(nèi)膜下細(xì)胞下調(diào)，加上I<,Ca>的非同步下調(diào)構(gòu)成了此

13、期AP跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)。(3)心衰期突出的變化是I<,t0>、I<,K,slow>內(nèi)、外膜下細(xì)胞非同步的下降，即內(nèi)膜減少大于外膜，構(gòu)成了AP跨壁異質(zhì)性增大的離子基礎(chǔ)。各種電壓依賴性K<'+>電流顯著的非同步下調(diào)，是心肌肥厚、心衰不同階段AP跨壁異質(zhì)性表現(xiàn)的重要基礎(chǔ)。 第四部分Calcineurin信號(hào)通路在失代償性心衰期K<'+>電流下調(diào)中的作用 目的：本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用calcineurin的特異性抑制劑環(huán)孢素A(C

14、sA)，阻斷calcineurin信號(hào)通路，觀察失代償性心衰期小鼠心室肌內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞電壓依賴性鉀電流I<,t0>，I<,K,slow>，I<,ss>的改變，意圖評(píng)價(jià)Ca<'2+><,i>/CaM-calcineurin-NFAT 通路在心衰期跨壁電壓依賴性鉀電流下調(diào)中的作用，為尋找可能的抗心律失常藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：在小鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥厚、心衰模型上，于術(shù)后9周起皮下注射CsA，25mg/Kg，2次/天，連續(xù)兩周。

15、實(shí)驗(yàn)分為：Band+CsA 組、Band+Veh組，為進(jìn)一步說明CsA 對(duì)正常和病理狀態(tài)下心肌作用的選擇性，Sham 周組中設(shè)與 Band 周同期的治療組和對(duì)照組，即Sham+CsA組、Sham+Veh組。測(cè)定各組內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞心質(zhì)量指數(shù)，并對(duì)各組心肌組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。同時(shí)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察了小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞膜電容及電壓依賴性鉀電流I<,t0>、I<,K,slow>及I<,ss>跨壁異質(zhì)性的變化。

16、 結(jié)論 1．小鼠左心室內(nèi)、外膜下細(xì)胞生理跨壁復(fù)極梯度的消失或增大分別構(gòu)成了肥厚、心衰兩個(gè)階段心律失常產(chǎn)生的細(xì)胞基礎(chǔ)。 2．生理狀態(tài)下小鼠左心室內(nèi)、外膜下細(xì)胞I<,Ca-L>與APD跨壁異質(zhì)性的產(chǎn)生無關(guān)；內(nèi)、外膜下細(xì)胞I<,Ca-L>非同步性改變，在肥厚、心衰兩個(gè)不同時(shí)期有著不同的作用：心肌肥厚時(shí)I 也非同步的變化可能是此期AP跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)，心衰時(shí)I<,Ca-L>的非同步變化在此期可起到對(duì)抗內(nèi)膜AP

17、D延長(zhǎng)，減少?gòu)?fù)極離散度的有益作用。 3．小鼠左心室各種電壓依賴性K<'+>電流顯著的非同步下調(diào)，是心肌肥厚、心衰不同階段AP跨壁異質(zhì)性表現(xiàn)的重要基礎(chǔ)。心肌肥厚階段I<,t0>、I<,ss>在內(nèi)、外膜下細(xì)胞呈同步減少，I<,K,slow>只是在內(nèi)膜下細(xì)胞下調(diào)，加上I<,Ca>的非同步下調(diào)構(gòu)成了此期 AP 跨壁梯度消失的離子基礎(chǔ)；心衰期突出的變化是I<,t0>、I<,K,slow>內(nèi)、外膜下細(xì)胞非同步的下降，即內(nèi)膜減少大于外膜，構(gòu)成

18、了AP跨壁異質(zhì)性增大的離子基礎(chǔ)。 4．calcineurin信號(hào)通路是I<,K,slow>病理性下調(diào)的主要原因。I<,t0>的下調(diào)除calcineurin 信號(hào)通路外還有其他信號(hào)調(diào)節(jié)途徑參與。抑制calcineurin信號(hào)通路可以對(duì)抗心衰病理狀態(tài)下電壓依賴性鉀電流I<,t0>，I<,K,slow>，I<,ss>的重構(gòu)，對(duì)內(nèi)膜下細(xì)胞的抑制作用明顯高于外膜下細(xì)胞，故降低了跨壁復(fù)極離散度。提示抑制該信號(hào)傳導(dǎo)通路可望成為心衰心律失常和猝