新型功能性雜交胰島β細(xì)胞系建立的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：
　　 糖尿病發(fā)病率逐年升高,目前全世界糖尿病患者已超過2億人,是嚴(yán)重危害人類健康的常見病之一。目前研究認(rèn)為胰島移植是治療1型糖尿病的有效手段之一,胰島移植具有操作簡單、安全性高、并發(fā)癥少及可重復(fù)性高等優(yōu)勢。2000年Edmonton方案的成功,標(biāo)志著胰島移植取得了突破性的進(jìn)展。但是分離大量高純度胰島仍有一定困難,而且胰島在分離過程中其生存微環(huán)境遭到破壞,移植到體內(nèi)后缺血缺氧、炎癥和免疫排斥反應(yīng)等不利因素使大量胰島細(xì)

2、胞發(fā)生調(diào)亡,這些因素都導(dǎo)致從單個供體胰腺獲取的胰島數(shù)量遠(yuǎn)不能滿足一個受體的需求。解決供胰短缺一種最有效途徑是在實(shí)驗(yàn)室建立可供移植并分泌胰島素的細(xì)胞系。該細(xì)胞系應(yīng)具有正常胰島β細(xì)胞特征,對血糖濃度變化敏感,根據(jù)血糖濃度變化合成和分泌胰島素。
　　 猿猴病毒40大T抗原基因(simian virus40 largeT antigen gene,SV40 Ltag)是最早被用來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的永生化的基因,目前已經(jīng)成功的介導(dǎo)了多種細(xì)胞的永生

3、化,如腎上腺嗜鉻細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等真核細(xì)胞。SV40由結(jié)構(gòu)蛋白(VP1,VP2,VP3)和兩種抗原(LT和st)組成,其中LT具有調(diào)控某些關(guān)鍵的腫瘤抑制因子和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的作用,它能結(jié)合腫瘤抑制因子p53和pRb,降低它們對細(xì)胞增殖的抑制作用,同時還有ATP酶和DNA解旋酶活性,能使ADP羰基化和乙?；?、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化,活化宿主細(xì)胞核糖體基因,誘導(dǎo)DNA合成,修飾蛋白質(zhì)合成起始因子等作用。目前SV40 Lta

4、g已被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞生物領(lǐng)域,以促使。
　　 本研究擬利用SV40 Ltag促使原代成纖維細(xì)胞發(fā)生永生化,以增加原代細(xì)胞的體外增殖能力。但是如果SV40 Ltag長期存在于細(xì)胞內(nèi),可導(dǎo)致潛在的致瘤性。因此從生物安全角度出發(fā)擬建立的雜交胰島β細(xì)胞在移植到體內(nèi)之前需要將SV40Ltag基因切除。本研究擬應(yīng)用條件基因敲除技術(shù)—Cre/LoxP位點(diǎn)重組酶系統(tǒng),聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞融合技術(shù)介導(dǎo)細(xì)胞永生化,又稱可復(fù)性永生化(reversib

5、leimmortalization),建立增殖可控、功能良好、無致瘤性的雜交胰島β細(xì)胞系,從而為解決移植胰島β細(xì)胞短缺提供新的思路及途徑。
　　 方法：
　　 (1)采用酶消化法提取胎鼠原代皮膚成纖維細(xì)胞,采用脂質(zhì)體法將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR69轉(zhuǎn)染原代大鼠成纖維細(xì)胞,篩選穩(wěn)定表達(dá)SV40 LTAg的永生化成纖維細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察原代和永生化成纖維細(xì)胞形態(tài),采用生長曲線法觀察它們體外增殖能力,細(xì)胞免疫熒光檢測其表達(dá)特性。

6、用表達(dá)Cre重組酶的腺病毒上清感染永生化成纖維細(xì)胞,篩選回復(fù)后成纖維細(xì)胞,采用平板克隆實(shí)驗(yàn)測定回復(fù)后細(xì)胞的致瘤性。分別用RT-PCR及Western blot技術(shù),在mRNA及蛋白水平,檢測SV40 LTAg基因在永生化細(xì)胞中的表達(dá)情況以及在回復(fù)后細(xì)胞中的切除情況。
　　 (2)采用改良的明尼蘇達(dá)大學(xué)方法分離純化原代大鼠胰島,以DTZ染色、AO/PI熒光染色、葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)鑒定大鼠胰島的產(chǎn)量、純度、活性及功能；采用胰酶

7、和DNA酶消化胰島細(xì)胞,獲取胰島單細(xì)胞懸液,AO/PI染色及葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)測定胰島單細(xì)胞的活性及功能。
　　 (3)采用電融合的方法將永生化成纖維細(xì)胞與胰島單細(xì)胞融合,采用有限稀釋法篩選雜交胰島β細(xì)胞克隆。對雜交胰島β細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察其形態(tài),透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu),繪制生長曲線測定其體外增殖能力。比較雜交胰島β細(xì)胞和原代胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量的差異,采用葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)測定二者對葡萄糖變化的敏

8、感性的差異。分別以永生化成纖維細(xì)胞和胰島β細(xì)胞為對照,應(yīng)用RT-PCR、Western blot在mRNA和蛋白水平檢測SV40 Ltag、Insulin、GK和Glut-2在雜交胰島β細(xì)胞中的表達(dá)情況,取不同代數(shù)的細(xì)胞檢測SV40 Ltag的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功提取大鼠皮膚成纖維細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR69轉(zhuǎn)染原代大鼠成纖維細(xì)胞后篩選出永生化成纖維細(xì)胞,兩者細(xì)胞形態(tài)無明顯差異,均貼壁生長,呈長梭

9、形或多角形,但永生化成纖維細(xì)胞體外增殖能力明顯高于原代成纖維細(xì)胞(P＜0.05),可以在體外培養(yǎng)傳代＞25代。細(xì)胞免疫熒光提示兩種細(xì)胞均在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)Vimentin。SV40 Itag基因在永生化細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),用表達(dá)Cre重組酶的腺病毒成功切除永生化細(xì)胞內(nèi)的SV40 Ltag基因,從而獲得回復(fù)后成纖維細(xì)胞,其體外增殖能力與原代細(xì)胞無明顯差異(P＞0.05),無致瘤性。
　　 (2)成功分離純化出純度＞95％、存活率＞95％的

10、原代大鼠胰島細(xì)胞,成功將胰島細(xì)胞消化分散成功能良好的胰島單細(xì)胞,胰島素釋放指數(shù)＞3,活性＞90％。
　　 (3)成功篩選出雜交胰島β細(xì)胞克隆,貼壁生長,呈短梭形或扁圓形,透射電鏡可以觀察到細(xì)胞內(nèi)有胰島素分泌顆粒,細(xì)胞內(nèi)胰島素含量及胰島素釋放指數(shù)與原代胰島β細(xì)胞相比,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。雜交胰島β細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代至10代以上,但隨著培養(yǎng)時間的延長,至第12代其增殖能力減弱。RT-PCR及Western blot提示第

11、8代和第12代雜交胰島β細(xì)胞在mRNA和蛋白水平均表達(dá)SV40 Ltag。雜交胰島β細(xì)胞Insulin、GK、Glut-2 mRNA和蛋白的表達(dá)量與原代胰島細(xì)胞相比,均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),與RIN-m5F細(xì)胞相比,均顯著增高(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)脂質(zhì)體可以成功介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體SSR69轉(zhuǎn)染大鼠成纖維細(xì)胞,從而獲得永生化大鼠成纖維細(xì)胞,此種永生化成纖維細(xì)胞可在體外持續(xù)增殖、穩(wěn)定傳代＞25

12、代,而且表達(dá)特性未發(fā)生變化。
　　 (2)以Cre/LoxP系統(tǒng)可以切除永生化大鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)的SV40 Ltag基因,從而獲得回復(fù)后成纖維細(xì)胞,回復(fù)后成纖維細(xì)胞生長特征與原代細(xì)胞相似,無致瘤性。
　　 (3)采用電融合的方法可以將永生化成纖維細(xì)胞與胰島單細(xì)胞融合,并最終獲得雜交胰島β細(xì)胞克隆。此雜交胰島β細(xì)胞對葡萄糖變化有一定敏感性,可以根據(jù)葡萄糖濃度的變化合成和分泌胰島素,但隨著培養(yǎng)時間的延長,其增殖能力減弱。在細(xì)胞