CDK5RAP2與乳腺癌變進(jìn)展的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分、 CDK5RAP2在乳腺癌中的差異表達(dá)
　　 目的：
　　 CDK5RAP2在中心體微管成核功能中具有重要的作用，該分子的突變將造成大腦發(fā)育障礙，即原發(fā)性小頭畸形（MCPH）。該分子在增生性疾病（如腫瘤）中的作用尚無報(bào)導(dǎo)，為此我們將乳腺癌引入到CDK5RAP2的研究中，首先制備該分子的單克隆抗體，通過成對乳腺癌組織芯片檢測其表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討CDK5RAP2在腫瘤發(fā)生過程中的可能作用奠定基礎(chǔ)。
　　

2、 方法：
　　 應(yīng)用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，并對單抗特異性進(jìn)行鑒定。在30例成對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織芯片上，采用該抗體進(jìn)行CDK5RAP2表達(dá)情況的初步檢測。RT-PCR檢測15例成對乳腺癌標(biāo)本的該因子mRNA表達(dá)水平，通過Western blot檢測6種乳腺癌細(xì)胞系中CDK5RAP2的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、細(xì)胞融合后，從甲基纖維素半固體培養(yǎng)基挑出788株克隆，ELISA檢測篩選出22株陽

3、性克隆，最終保留5株滴度高的單抗，選擇DG10克隆進(jìn)行腹水制備和抗體純化。通過分段表達(dá)蛋白及CDK5RAP2敲除的細(xì)胞免疫熒光檢測證明該單抗良好的特異性。
　　 2、30例成對標(biāo)本組織芯片中，與癌旁正常組織相比，浸潤性導(dǎo)管癌中CDK5RAP2表達(dá)升高有20例，陽性率約66.7％。RT-PCR檢測mRNA的表達(dá)水平，15例中有11例癌組織的表達(dá)高于癌旁正常組織，陽性率約73.3％。Western blot檢測在6種乳腺癌細(xì)胞（T4

4、7D、MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、ADR）CDK5RAP2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)6種細(xì)胞均有不同程度的表達(dá)，而轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的MDA-MB-435和MDA-MB-231細(xì)胞的表達(dá)高于其他細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，成功制備了CDK5RAP2單抗。實(shí)驗(yàn)表明應(yīng)用該方法大大提高了克隆效率，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　 2、CDK5RAP2在

5、乳腺癌中表達(dá)升高，與癌旁正常乳腺組織有明顯的差別，并且陽性率70％左右，表明該因子與乳腺癌的形成具有某種聯(lián)系。結(jié)合前期CDK5RAP2體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行推斷：CDK5RAP2控制微管核化的功能可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，在乳腺癌的進(jìn)展中起到重要作用。
　　 第二部分、 CDK5RAP2在乳腺癌變過程中表達(dá)的變化
　　 目的：
　　 將癌前病變、導(dǎo)管原位癌引入到研究中，觀察CDK5RAP2在乳腺癌從正常到癌變的各個(gè)階

6、段的表達(dá)變化。
　　 方法：
　　 選取正常乳腺組織及輕度增生（N）、癌前病變（Pre-Ca）、導(dǎo)管內(nèi)癌（DCIS）和浸潤性導(dǎo)管癌（IDC）石蠟包埋標(biāo)本各30例，新鮮標(biāo)本各15例，應(yīng)用抗CDK5RAP2單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色；從新鮮手術(shù)標(biāo)本中提取RNA，采用熒光定量PCR的方法檢測各組CDK5RAP2基因mRNA的表達(dá)，所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDK5RA

7、P2在癌前病變、DCIS及IDC組中均有表達(dá)，與正常乳腺組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P<0.001。三組CDK5RAP2高表達(dá)率分別為57％、73％、83％，呈現(xiàn)遞增的趨勢。
　　 2、熒光定量PCR結(jié)果顯示IDC組CDK5RAP2的mRNA的表達(dá)比其他三組顯著增高P<0.001：四組病例的表達(dá)亦呈遞增的趨勢，與免疫組化結(jié)果一致，癌前病變、DCIS及IDC的表達(dá)量分別是正常乳腺組的2.8、3.7和11.8倍。
　　 結(jié)論：<

8、br>　　 1、CDK5RAP2在乳腺癌前病變、DCIS及IDC中均有表達(dá)，與正常乳腺組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明該因子在早期病變中即發(fā)揮作用，有可能成為乳腺癌早期診斷的標(biāo)志物之一。
　　 2、CDK5RAP2在乳腺癌前病變、DCIS及IDC中的表達(dá)具有逐步遞增的趨勢，提示該因子對于乳腺癌的進(jìn)展可能具有促進(jìn)作用，對于研究乳腺癌發(fā)生進(jìn)展的機(jī)制具有重要的提示作用。
　　 3、CDK5RAP2促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的可能機(jī)制為：細(xì)胞異

9、常增生，伴隨中心體異常，CDK5RAP2通過其微管成核作用，加速了異常細(xì)胞的分裂與傳代，促使惡性細(xì)胞的不斷累積，導(dǎo)致了乳腺從癌前病變的不典型增生到DCIS，最終發(fā)展為IDC的惡變進(jìn)程。
　　 4、CDK5RAP2在乳腺癌中的高表達(dá)為建立“微管成核能力增強(qiáng)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展”這一新理論提供了證據(jù)。
　　 第三部分、 CDK5RAP2的表達(dá)與乳腺癌臨床病理因素相關(guān)性研究
　　 目的：
　　 進(jìn)行CDK5RAP2大樣

10、本檢測，通過臨床病理資料的回顧性研究，分析其可能相關(guān)的臨床病理指標(biāo)。
　　 方法：
　　 采用具有10年隨訪的大樣本乳腺癌病例的組織芯片，進(jìn)行CDK5RAP2的免疫染色，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)關(guān)系，繪制Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型行單因素和多因素分析來評估影響腫瘤患者生存的預(yù)后因子。
　　 結(jié)果：
　　 1、大樣本組織芯片檢測CDK5RAP2陽性率為61.4％。CD

11、K5RAP2蛋白表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P=0.002），而與其他臨床病理指標(biāo)，如患者年齡，絕經(jīng)狀態(tài)，腫瘤組織學(xué)分級等不存在顯著相關(guān)性。其中與腫瘤大小、PR的相關(guān)性處于臨界值，分別為0.059和0.053。
　　 2、生存分析顯示CDK5RAP2高表達(dá)對患者的無瘤生存及總體生存均有明顯地影響，說明該因子與預(yù)后不良有關(guān)。通過單因素分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)和CDK5RAP2表達(dá)與乳腺癌的復(fù)發(fā)及總體生存相關(guān)，可作為乳腺癌

12、提示預(yù)后的指標(biāo)。該樣本又經(jīng)多因素分析，發(fā)現(xiàn)與復(fù)發(fā)相關(guān)的因素仍舊是上述三個(gè)指標(biāo)，與總體生存相關(guān)的因素只有淋巴結(jié)狀態(tài)和CDK5RAP2表達(dá)，說明兩者與乳腺癌的預(yù)后最為相關(guān)，可以獨(dú)立或協(xié)同發(fā)揮作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、CDK5RAP2蛋白表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并與患者的腫瘤復(fù)發(fā)與預(yù)后不良有關(guān)。
　　 2、結(jié)合前兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行推斷：在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，CDK5RAP2不僅僅是一種細(xì)胞生長促進(jìn)劑，通過