乳腺癌易感基因BRCA1沉默與散發(fā)性乳腺癌發(fā)病相關(guān)性的研究.pdf

1、目的： 本研究擬檢測較大樣本的乳腺組織中，乳腺癌易感基因 BRCA1 啟動子 CpG 區(qū)甲基化狀態(tài)，結(jié)合BRCA1蛋白的表達情況，探討乳腺癌易感基因 BRCA1在散發(fā)性乳腺癌中沉默的機制；檢測 BRCA1 基因在非癌性乳腺組織、BRCA1 啟動子甲基化和非甲基化的乳腺癌組織中的拷貝數(shù)，探討B(tài)RCA1基因啟動子甲基化與BRCA1基因位點缺失的關(guān)系，散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病機制。 方法: 免疫組織化學(immunohist

2、ochemistry，IHC)SP法檢測 98 例散發(fā)性乳腺癌和12例非癌性乳腺組織石蠟標本BRCA1蛋白的表達情況。并分析BRCA1 蛋白表達與臨床病理學參數(shù)(患者年齡、乳腺癌病理類型、病理組織學分級、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、雌、孕激素受體水平)，及與其他抑癌基因和癌基因(p53、C-myc、bel-2和HER-2)蛋白表達之間的關(guān)系。甲基化特異性PCR技術(shù)(methylation specific PCR，MSP)檢測98例乳腺癌和12例非癌

3、性乳腺組織的冰凍標本 BRCA1 啟動子區(qū) CpG 島甲基化水平，結(jié)合BRCA1蛋白表達情況，分析 BRCA1 啟動子甲基化與 BRCA1 蛋白表達、臨床病理指標和相關(guān)調(diào)控蛋白表達間的關(guān)系。采用間期核雙色熒光免疫原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)，檢測在非癌性乳腺組織、BRCA1 基因啟動子甲基化和非 BRCA1 甲基化的散發(fā)性乳腺癌組織中 BRCA1 基因和 17 號染色體著

4、絲粒(CEP17)在17號染色體的拷貝數(shù)，計算拷貝的平均值和 BRCA1/CEP17 的比率，分析 BRCA1 啟動子甲基化與BRCA1基因拷貝數(shù)之間的關(guān)系。 結(jié)果： 一、BRCA1 蛋白在乳腺組織中的表達：免疫組織化學檢測結(jié)果表明，BRCA1 蛋白在非癌性乳腺組織中的細胞核陽性表達率為100％(12/12)，未見細胞漿表達；在散發(fā)性乳腺癌組織中，BRCA1 在細胞漿和細胞核均見表達，BRCA1 在細胞核的陽性表達率為

5、53.1％(52/98)。 二、散發(fā)性乳腺癌組織中BRCA1表達與臨床病理指標的相關(guān)性：免疫組化學檢測顯示，乳腺癌組織學分級Ⅰ級為29例(29.6％)，Ⅱ級為42例(42.9％)，Ⅲ級為27例(27.5％)。BRCA1 蛋白表達陽性率在組織學分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分別為 72.4％(21/29)、50.0％(21/42)和37.0％(10/27)；其中BRCA1蛋白中度表達，在組織學分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中分別占27.6％(8/29)、4.8

6、％(2/42)和0.0％(0/27)；低度表達在各組織分級比率分別為44.8％(13/29)、45.2％(19/42)和 37.0％(10/27)；BRCA1 蛋白表達陰性率分別為27.6％(8/29)、50.0％(21/42)和63.0％(17/27)。組織學分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中BRCA1蛋白陽性表達在細胞核的比率分別為 55.2％(16/29)、40.5％(17/42)和 11.1％(3/27)。BRCA1 蛋白陽性表達率與組織學分級呈

7、負相關(guān)(P<0.01)，組織學分級越高，BRCA1 蛋白表達越少。病例中腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 45 例(45.9％)，無轉(zhuǎn)移53例(54.1％)。BRCA1 蛋白中度表達的腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率10％(1/10)，低度表達的轉(zhuǎn)移率38.1％(16/42)，BRCA1 蛋白表達陰性的腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為60.9％(28/46)。BRCA1蛋白在細胞核陽性表達伴有腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為19.4％(7/36)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為80.6％(29/36)。BRCA1 蛋白

8、細胞核陽性表達與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)(P<0.01)。BRCA1 蛋白表達與散發(fā)性乳腺癌雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)蛋白表達之間元顯著相關(guān)性。 三、散發(fā)性乳腺癌組織中BRCA1表達與相關(guān)調(diào)控基因蛋白表達的相關(guān)性：HER-2 低表達的乳腺癌BRCA1細胞核表達陽性率為45.2％(14/31)，HER-2 中、高度表達的乳腺癌組織BRCA1細胞核表達陽性率為11.1％(1/9)和0.0％(0/5)，BRCA1 細胞核表達陰

9、性的乳腺癌組織HER-2表達增高(P<0.05)。其他相關(guān)調(diào)控蛋白(p53、bcl-2 和 C-myc)在BRCA1表達陰性的乳腺癌組織中，陽性表達率普遍高于BRCA1中度表達的乳腺癌組織，但無差異顯著性。 四、乳腺組織中BRCA1啟動子甲基化檢測：應用MSP方法檢測了12例非癌性乳腺組織和98例散發(fā)性乳腺癌組織BRCA1基因啟動子甲基化水平，在12例非癌性乳腺組織中，未檢測到BRCA1啟動子CpG區(qū)甲基化；在98例散發(fā)性乳腺癌

10、組織中，檢測到15例BRCA1啟動子CpG區(qū)異常甲基化，占所檢測散發(fā)性乳腺癌病例的 15.3％(15/98)。 五、BRCA1啟動子甲基化與BRCA1蛋白及相關(guān)調(diào)控基因蛋白表達的相關(guān)性：MSP檢測的98例散發(fā)性乳腺癌中，15例BRCA1啟動子CpG區(qū)異常甲基化，結(jié)合免疫組化結(jié)果，該15例的細胞核BRCA1蛋白表達均為陰性，占BRCA1蛋白表達陰性病例的32.6％(15/46)。BRCA1 啟動子甲基化與BRCA1蛋白細胞核陰性表

11、達密切相關(guān)(P <0.01)。BRCA1 啟動子甲基化與相關(guān)調(diào)控蛋白bcl-2、p53、HER-2和c-myc表達之間，未見明顯相關(guān)性。 六、BRCA1 基因啟動子甲基化與乳腺癌臨床病理指標的相關(guān)性：病理組織學分級Ⅰ級的乳腺癌組織，3.4％的病例檢測到 BRCA1 啟動子甲基化；而病理組織學分級Ⅲ級的乳腺癌，29.6％的病例檢測到 BRCA1 啟動子甲基化，差異性顯著(P<0.05)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的散發(fā)性乳腺癌組織，24.4％(1

12、1/45)的病例BRCA1啟動子甲基化，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中7.5％(4/53)的BRCA1 啟動子甲基化比率，差異性顯著(P<0.05)。 七、BRCA1拷貝數(shù)與BRCA1啟動子甲基化的相關(guān)性：雙色FISH檢測非癌性乳腺組織 3 例、BRCA1 啟動子甲基化乳腺癌12和非甲基化的散發(fā)性乳腺癌組織 5 例的 BRCA1 基因拷貝，計數(shù)均值和BRCA1單拷貝和多拷貝所占比例。非癌性乳腺組織中，BRCA1基因平均拷貝數(shù)

13、為2.05±0.09；BRCA1 啟動子甲基化的乳腺癌BRCA1基因平均拷貝數(shù)為1.41±0.18，低于非甲基化的散發(fā)性乳腺癌組織的 BRCA1 平均拷貝數(shù).1.98±0.09，差異顯著(P<0.05)。BRCA1啟動子甲基化的乳腺癌 BRCA1 單拷貝比例為(22.04±1.06)％，高于 BRCA1 啟動子非甲基化乳腺癌 BRCA1 單拷貝比例(2.56±0.32)％、非癌性乳腺組織中 BRCA1 單拷貝比率(0.84±0.03)％

14、，差異性顯著(P<0.01)。BRCA1 啟動子非甲基化乳腺癌 BRCA1基因多拷貝間期核的比例為(20.86±1.92)％，明顯高于 BRCA1 啟動子甲基化乳腺癌中(1.47±0.20)％的比例、非癌性乳腺組織中 BRCA1 多拷貝比率(1.12±0.08)％之間，有顯著性差異(P<0.01)。BRCA1 啟動子甲基化乳腺癌BRCA1基因平均拷貝數(shù)減少，單拷貝比率增加。 八、BRCA1/CEP17拷貝數(shù)比率與BRCA1啟動子

15、甲基化的相關(guān)性：雙色FISH檢測乳腺非癌性組織、BRCA1 啟動子甲基化和非甲基化的散發(fā)性乳腺癌組織中 CEP17 拷貝，計算平均值和BRCA1/CEP17的平均拷貝比率。非癌性乳腺組織中，CEP17的平均拷貝數(shù)為2.33±0.17；BRCA1 啟動子甲基化的散發(fā)性乳腺癌組織中 CEP17 平均拷貝數(shù)為 1.92±0.19，低于非甲基化乳腺癌中平均拷貝數(shù)2.39±0.46，但沒有差異顯著性。BRCA1 啟動子甲基化的乳腺癌 CEP17

16、單拷貝的比例為(24.60±2.09)％，高于BRCA1 啟動子非甲基化乳腺癌CEP17單拷貝的比例(3.31±0.23)％、非癌性乳腺組織中CEP17單拷貝比率(1.04±0.07)％，差異性顯著(P<0.01)。BRCA1 啟動子非甲基化乳腺癌 CEP17 多拷貝間期核的比例為(23.2±1.98)％，明顯高于BRCA1啟動子甲基化乳腺癌中(2.02±0.22)％的比例，非癌性乳腺組織中 CEP17 多拷貝比率(1.46±0.11)

17、％，有顯著性差異(P<0.01)。BRCA1/CEP17比率在BRCA1啟動子甲基化乳腺癌中平均為0.74±0.11，與非甲基化乳腺癌中的平均值0.85±0.13、非癌性乳腺組織中BRCA1/CEP17比率的均值0.88±0.05之間，無差異顯著性。 結(jié)論： 一、BRCA1 蛋白在非癌性乳腺組織中均為細胞核陽性表達；在散發(fā)性乳腺癌組織中細胞核陽性表達下降，且與散發(fā)性乳腺癌的病理組織學分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2異常擴增