環(huán)氧合酶-2(COX-2)促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子的篩選和功能鑒定.pdf

1、【背景】
　　胃癌是世界范圍尤其是亞洲地區(qū)的常見惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確。研究顯示，環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase2,COX-2)在多數(shù)胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)異常增高，它可以促進(jìn)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移及血管的形成，并且與胃癌的低生存率密切相關(guān)。而抑制COX-2的活性可以抑制胃癌相關(guān)的血管生成，而且能抑制胃癌細(xì)胞增殖，使凋亡增加，體內(nèi)成瘤減小，前列腺素合成受到抑制。這提示COX-2與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但其機(jī)制并不

2、清楚。蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來(lái)出現(xiàn)的能夠全貌性研究差異蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主流技術(shù)[1]，能夠有效地比較不同蛋白質(zhì)組之間的差異，是查找特征性功能蛋白質(zhì)、篩選蛋白效應(yīng)分子和疾病相關(guān)標(biāo)志物的有力手段。在本課題研究中，我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對(duì)COX-2siRNA及空載體轉(zhuǎn)染的SGC7901人胃癌細(xì)胞系進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以篩選與COX-2導(dǎo)致胃癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，并對(duì)下游分子進(jìn)行功能鑒定，

3、還利用全基因組芯片和轉(zhuǎn)錄因子芯片對(duì)COX-2的下游效應(yīng)分子進(jìn)行了高通量的篩選，從而為揭示COX-2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)理、確定新的胃癌基因治療靶點(diǎn)及提供新的胃癌疫苗候選分子提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　【目的】
　　1、篩選COX-2促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子；2、研究目的分子15-羥基前列腺素脫氫酶與COX-2在胃癌中的相關(guān)性；3、研究15-羥基前列腺素脫氫酶在胃癌中的表達(dá)與臨床病理特征及臨床分期的關(guān)系，探討其在

4、胃癌發(fā)生和進(jìn)展中的意義；4、觀察15-羥基前列腺素脫氫酶對(duì)胃癌細(xì)胞惡性表型的影響。
　　【方法】
　　1、采用雙向凝膠電泳技術(shù)、銀染顯色及PDQuest軟件分析篩選COX-2siRNA及空載體轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細(xì)胞系中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，而后用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)對(duì)表達(dá)存在顯著性變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，將所得蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)行生物信息學(xué)分析；2、應(yīng)用Westernblot

5、和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)COX-2和15-PGDH在COX-2siRNA載體和COX-2全長(zhǎng)載體轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)；3、采用免疫組織化學(xué)和Westernblot技術(shù)檢測(cè)COX-2和15-PGDH在胃癌組織中的表達(dá)特征；4、分析COX-2與15-PGDH表達(dá)的相關(guān)性以及它們的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系；5、通過基因重組方法構(gòu)建15-PGDHsiRNA及15-PGDH全長(zhǎng)載體，并分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MKN45和SGC7901胃癌細(xì)

6、胞系；6、應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、平板克隆實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)的方法研究15-PGDH對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和體內(nèi)成瘤能力的影響；7、采用全基因組表達(dá)譜芯片和轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片篩選COX-2下游效應(yīng)分子。
　　【結(jié)果】
　　1、蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出14個(gè)差異蛋白質(zhì)
　　Westernblot技術(shù)檢測(cè)COX-2siRNA載體轉(zhuǎn)染SGC7901胃癌細(xì)胞后COX-2的表達(dá)，結(jié)果顯示，COX-2siRNA能顯著

7、下調(diào)COX-2的表達(dá)，其中以第1號(hào)siRNA的抑制效率最高。因此，我們采用第1號(hào)siRNA轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象。將細(xì)胞系樣品總蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳，通過軟件分析后，對(duì)22個(gè)表達(dá)明顯改變的蛋白質(zhì)點(diǎn)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)分析鑒定，獲得14個(gè)蛋白質(zhì)的相應(yīng)肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)。其中，對(duì)比空載體轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞，COX-2siRNA轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞系中有7個(gè)蛋白顯著下調(diào)

8、，7個(gè)蛋白顯著上調(diào)。對(duì)PMF進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，生物信息學(xué)分析鑒定出在COX-2siRNA轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞系中下調(diào)的7個(gè)蛋白質(zhì)是：細(xì)胞分裂周期蛋白16(Celldivisioncycleprotein16)，肌動(dòng)蛋白γ(GammaActin)，14-3-3蛋白σ(14-3-3proteinsigma)，波形蛋白(Vimentin)，71kDa熱休克同源蛋白(Heatshockcognate71kDaprotein)，組胺-N-甲基轉(zhuǎn)

9、移酶(HistamineN-methyltransferase)，Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-3B(Ras-relatedproteinRab-3B)；而上調(diào)的7個(gè)蛋白質(zhì)是：乳酸酰谷胱苷肽裂解酶(Lactoylglutathionelyase)，15-羥基前列腺素脫氫酶(15-hydroxyprostaglandindehydrogenase[NAD+])，補(bǔ)體成分1q亞成分結(jié)合蛋白(Complementcomponent1qsubcompo

10、nentbindingprotein)，生長(zhǎng)分化因子2(Growthdifferentiationfactor2)，熱休克70kDa蛋白5(Heatshock70kDaprotein5)，磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白β亞型(Phosphatidylinositoltransferproteinbetaisoform)，應(yīng)激蛋白70(Stress-70protein)。其中15-羥基前列腺素脫氫酶(15-PGDH)是在COX-2siRNA轉(zhuǎn)染的胃癌

11、細(xì)胞中顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)之一，我們用Westernblot及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)證實(shí)了這一結(jié)果。
　　2、15-PGDH在胃癌中表達(dá)降低并與COX-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
　　我們應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)8例胃癌手術(shù)組織標(biāo)本中COX-2與15-PGDH的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的癌旁組織相比，在胃癌組織中COX-2表達(dá)顯著升高，而15-PGDH的蛋白表達(dá)水平明顯降低甚至缺失；我們應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)15-PGDH在55例胃癌患者手術(shù)標(biāo)本

12、的連續(xù)石蠟切片中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常胃粘膜上皮相比，15-PGDH在胃癌組織中表達(dá)顯著降低甚至缺失，而COX-2表達(dá)顯著增高；進(jìn)一步分析COX-2及15-PGDH的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)15-PGDH在低分化胃癌中明顯低于高分化胃癌中的表達(dá)(p<0.05)；15-PGDH在TNMⅢ期和Ⅳ期患者的胃癌組織中的染色明顯低于于在Ⅰ期和Ⅱ期組織中的表達(dá)(p<0.05)；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中15-PGDH表達(dá)顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃

13、癌組織中的表達(dá)(p<0.05)，而COX-2的表達(dá)與15-PGDH的表達(dá)模式相反。Spearsman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示15-PGDH的表達(dá)與COX-2呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.564,p<0.01)。Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)COX-2正義表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細(xì)胞系COX-2和15-PGDH的表達(dá)，結(jié)果顯示COX-2正義載體能顯著提高COX-2的表達(dá)水平，而15-PGDH在COX-2正義轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞中

14、顯著下調(diào)。結(jié)果表明胃癌組織中15-PGDH的表達(dá)顯著降低，在低分化、TNM晚期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)更低，其表達(dá)與COX-2呈顯著負(fù)相關(guān)，且上調(diào)COX-2能抑制15-PGDH的表達(dá)，提示在胃癌中15-PGDH受到了COX-2的負(fù)調(diào)節(jié)。
　　3、外源性高表達(dá)15-PGDH可以降低胃癌細(xì)胞惡性表型，15-PGDH的特異性小干擾RNA可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。
　　Westernblot檢測(cè)了SGC7901、AGS、BGC823、

15、MKN45、MKN28五種胃癌細(xì)胞系和永生化正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES中15-PGDH的表達(dá)，結(jié)果顯示15-PGDH在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)均低于GES細(xì)胞，在MKN45細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較高，在SGC7901細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)更低。我們用以色列的IdoWolf教授惠贈(zèng)的15-PGDH正義表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了SGC7901細(xì)胞，該正義載體能顯著提高SGC7901中15-PGDH的表達(dá)。15-PGDH的正義轉(zhuǎn)染可使SGC7901細(xì)胞體外增殖減慢，在平板

16、和軟瓊脂上形成克隆的能力降低，裸鼠體內(nèi)成瘤性也降低，瘤體積明顯減小，生長(zhǎng)減緩，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞阻滯于G1期。我們構(gòu)建了15-PGDH的siRNA表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了MKN45細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該siRNA能顯著抑制15-PGDH的表達(dá)，并能夠明顯促進(jìn)MKN45在體外的生長(zhǎng)增殖，在平板和軟瓊脂中形成克隆的能力及裸鼠體內(nèi)的成瘤能力增強(qiáng)。上述結(jié)果提示，15-PGDH參與了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等多種生物學(xué)行為的變化，且提高15-PGDH的表達(dá)能

17、降低胃癌細(xì)胞的惡性表型。
　　4、差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子及差異表達(dá)基因的篩選
　　利用核蛋白提取試劑盒(Piercebiotechnology)分別抽提COX-2siRNA和空載體轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細(xì)胞的核蛋白，并用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片分析，以變化倍數(shù)1.5倍為標(biāo)準(zhǔn)判定差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，SGC7901-COX-2/siRNA細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有4個(gè)，下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)

18、錄因子有2個(gè)。
　　經(jīng)過Trizol法抽提COX-2siRNA和空載體轉(zhuǎn)染的SGC7901胃癌細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)顯示所提取的RNA符合基因芯片測(cè)定的要求。經(jīng)芯片雜交、圖像采集及數(shù)據(jù)分析等步驟，以變化倍數(shù)2倍為標(biāo)準(zhǔn)判定差異表達(dá)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比，SGC7901-COX-2/siRNA細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的基因有1040個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有234個(gè)。
　　【結(jié)論】
　　1、本研究通過比較蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出不同COX

19、-2表達(dá)水平胃癌細(xì)胞系的差異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等諸多功能，可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移過程中起到重要的作用；2、進(jìn)一步對(duì)差異蛋白質(zhì)15-PGDH的研究顯示15-PGDH在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中起著抑癌基因的作用，并且受到COX-2的負(fù)調(diào)控，而且轉(zhuǎn)染15-PGDH全長(zhǎng)的表達(dá)載體能夠提高胃癌細(xì)胞中15-PGDH的表達(dá)并在一定程度上逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的惡性表型；3、用基因芯片和轉(zhuǎn)錄因子芯片篩選