Fgfr2S252W-+小鼠骨量、骨結(jié)構(gòu)特性及BMSCs成骨分化調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　Apert綜合征(Apert syndrome，AS)是臨床最嚴(yán)重的人類顱縫早閉。本研究將以Fgfr2S252W/+小鼠和BMSCs作為研究平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)切入點(diǎn)，通過比較野生型小鼠和Fgfr2S252W/+小鼠的長骨骨量、BMSCs的生物學(xué)特性、BMSCs成骨分化能力、BMSCs的基因差異表達(dá)，從整體動(dòng)物水平、細(xì)胞及分子水平研究FGFR2S252W突變中BMSCs的生物學(xué)變化、FGFR2 S252W突變對(duì)BMSCs成骨分化

2、的調(diào)控作用及其分子機(jī)制、FGFR2調(diào)控BMSCs成骨分化中與其它信號(hào)通路的協(xié)同作用。本研究不僅對(duì)于深入認(rèn)識(shí)Apert綜合征病理生理機(jī)制意義重大，而且能夠揭示FGFR2參與調(diào)控BMSCs成骨分化的作用及機(jī)制，為骨再生和骨骼相關(guān)疾病治療的新策略提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　為了獲取Fgfr2S252W/+小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，我們首先對(duì)Fgfr2S252W/+小鼠進(jìn)行保種、繁殖、基因型鑒定。Micro-CT掃描并分析來自2月齡和

3、5月齡小鼠的股骨骨量。骨量的分析數(shù)據(jù)包括:骨小梁和骨皮質(zhì)體積分?jǐn)?shù)(Tb.BV/TV，Ct.BV/TV，％)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)，骨小梁和骨皮質(zhì)的厚度(Tb.Th，Ct.Th)，骨小梁分離(Tb.Sp)，骨小梁結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(Tb.SMI)，骨小梁和皮質(zhì)骨礦物質(zhì)密度(Tb.BMD，CT.BMD)。利用H&E染色和Von Kossa染色對(duì)脫鈣骨和未脫鈣骨進(jìn)行組織學(xué)分析，以確定Fgfr2S252W/+小鼠中骨量的改變是否是由于骨骼的形成改變

4、導(dǎo)致。OsteoMeasure系統(tǒng)分析脛骨的Tb.BV/TV和Tb.Sp。測定小鼠血清中總鈣和磷酸鹽水平，以確定在Fgfr2S252W/+小鼠中觀察到的骨骼異常是否與系統(tǒng)性的礦物質(zhì)平衡改變有關(guān)。PINP是一種敏感和特異性的成骨細(xì)胞活性標(biāo)志物，所以我們用ELISA法檢測血清中PINP的水平。
　　從6至8周齡同窩野生型和Fgfr2S252W/+小鼠股骨和脛骨獲得BMSCs。利用流式細(xì)胞儀技術(shù)對(duì)野生型和Fgfr2S252W/+小鼠來源

5、的BMSCs進(jìn)行干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的檢測。為了比較野生型和Fgfr2S252W/+小鼠來源的BMSCs的功能，我們采用CCK-8法以及流式細(xì)胞儀檢測BMSCs增殖、生長周期以及凋亡。為了進(jìn)一步比較兩種小鼠來源的BMSCs多向分化能力差異，對(duì)兩種BMSCs進(jìn)行了成骨和成脂的定向誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，同時(shí)采用油紅O染色和茜素紅染色對(duì)脂滴和礦化結(jié)節(jié)進(jìn)行檢測，采用RT-PCR對(duì)成骨以及成脂的關(guān)鍵基因Oc、Runx2與PPARγ、LPL進(jìn)行檢測。

6、>　　為了解FGFR2功能獲得性突變對(duì)小鼠BMSCs成骨分化能力的影響，我們對(duì)W-BMSCs和M-BMSCs兩組細(xì)胞進(jìn)行成骨能力檢測。首先將BMSCs成骨誘導(dǎo)4d、7d、14d后，檢測成骨早期標(biāo)志基因ALP的活性和染色。然后將BMSCs成骨誘導(dǎo)7d、14d和21 d后采用免疫熒光方法檢測成骨的關(guān)鍵蛋白Op，Oc的表達(dá)情況，同時(shí)采用RT-PCR進(jìn)一步確定細(xì)胞成骨基因Col-Ⅰ，Op，Oc，Runx2和OSX的表達(dá)水平。最后將細(xì)胞成骨誘導(dǎo)2

7、1d后，采用茜素紅染色檢測其礦化能力。
　　為研究FGFR2 S252W功能獲得性突變影響下BMSCs成骨分化中與其它信號(hào)通路的協(xié)同作用，我們利用基因芯片技術(shù)比較分析W-BMSCs和M-BMSCs兩組細(xì)胞基因差異表達(dá)，找到有意義的基因。利用基因芯片技術(shù)中聚類分析芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，M-BMSCs中Wnt信號(hào)通路的抑制基因SFRP1、SFRP2和SFRP4表達(dá)上調(diào)。這種上調(diào)采用RT-PCR和Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。SFRP1

8、、SFRP2和SFRP4是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的拮抗劑，我們猜測Wnt/β-catenin信號(hào)通路在FGFR2 S252W功能獲得性突變下受到了抑制。為驗(yàn)證這一猜想，我們將W-BMSCs和M-BMSCs成骨誘導(dǎo)7d和21 d，分離提取胞漿、胞核蛋白，利用Western Blot檢測Wnt/β-catenin信號(hào)通路的樞紐分子β-catenin的表達(dá)情況，RT-PCR檢測Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵靶向基因cycl

9、inD1，lef1，and fzd4的表達(dá)水平。
　　如果Fgfr2S252W/+小鼠中BMSCs的生物學(xué)特性及成骨分化異常是由于Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制造成，那么Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活可以減輕BMSCs的異常。Wnt3a可以上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，此部分實(shí)驗(yàn)我們將應(yīng)用Wnt3a外源性重組蛋白調(diào)控Wnt信號(hào)通路。采用CCK-8分析加入Wnt3a后M-BMSCs細(xì)胞增殖能力，RT-P

10、CR檢測成骨基因Op，Oc，Runx2，OSX，Col-Ⅰ以及成脂基因PPARγ、LPL的變化趨勢，ALP和茜素紅染色觀察改變Wnt信號(hào)通路活性后M-BMSCs成骨能力和礦化能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠股骨結(jié)構(gòu)參數(shù)數(shù)據(jù)顯示，2月齡Fgfr2S252W/+小鼠中Tb.N，Tb.Th，Ct.Th，Tb.BV/TV，Ct.BV/TV，Tb.BMD和Ct.BMD均低于野生型小鼠。
　　2.與W-BMSCs細(xì)胞相比，M

11、-BMSCs的細(xì)胞形態(tài)無顯著性差異，但細(xì)胞數(shù)量較少。
　　3.ALP染色和活性檢測結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)4d、7d和14d時(shí)，M-BMSCs的ALP活性低于W-BMSCs，除14d外，其差異有顯著性。免疫熒光結(jié)果顯示在成骨誘導(dǎo)7d、14d和21 d后W-BMSCs、M-BMSCs兩組細(xì)胞均表達(dá)成骨早期和晚期標(biāo)志性蛋白Oc、Op。RT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)GFR2 S252W功能獲得性突變作用下，BMSCs成骨誘導(dǎo)4d時(shí)Col-I、Op、

12、Oc、Runx2、OSX的表達(dá)水平顯著低于W-BMSCs。
　　4.利用基因芯片技術(shù)中聚類分析芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，M-BMSCs中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制基因SFRP1、SFRP2和SFRP4表達(dá)上調(diào)。RT-PCR和Western Blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了SFRP1、SFRP2和SFRP4的表達(dá)上調(diào)。
　　5.加入Wnt3a，上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，M-BMSCs增殖能力增強(qiáng)。成脂誘導(dǎo)之后觀察

13、到M-BMSCs的成脂分化能力顯著增強(qiáng)。
　　結(jié)論:
　　1、對(duì)2月齡和5月齡Fgfr2S252W/+小鼠長骨的骨量、骨結(jié)構(gòu)特性及成骨細(xì)胞活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，F(xiàn)gfr2S252W/+小鼠的骨量沒有喪失，反而增加，與野生型相比，2月齡Fgfr2S252W/+小鼠骨發(fā)育受到抑制而5月齡Fgfr2S252W/+小鼠骨發(fā)育反而高于野生型。其原因與全身機(jī)體的系統(tǒng)性礦物質(zhì)平衡無關(guān)，可能是由成骨細(xì)胞的活性改變。
　　2

14、、FGFR2 S252W功能獲得性突變未改變小鼠BMSCs干細(xì)胞標(biāo)記物特點(diǎn)，但影響了干細(xì)胞的數(shù)量、增殖能力、多向分化能力及凋亡。這為進(jìn)一步探討Fgfr2S252W/+小鼠BMSCs的功能提供了基礎(chǔ)。
　　3、FGFR2 S252W功能獲得性突變?cè)诔晒欠只缙贐MSCs的骨向分化潛能受到抑制，但在晚期卻促進(jìn)BMSCs的成骨礦化。這與小鼠體內(nèi)觀察到的與年齡相關(guān)的骨發(fā)育狀況的改變情況一致。
　　4、FGFR2 S252W功能獲得性

15、突變抑制了BMSCs的Wnt/β-catenin經(jīng)典信號(hào)通路。并且通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠恢復(fù)或部分逆轉(zhuǎn)BMSCs增殖、成脂分化及骨向分化功能的異常。提示:Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制可能是FGFR2 S252W功能獲得性突變的BMSCs成脂、成骨分化能力改變的主要原因之一。
　　總之，本研究確證了與年齡相關(guān)的Fgfr2S252W/+骨量和骨結(jié)構(gòu)特性表型的改變，同時(shí)證實(shí)Wnt/β-catenin經(jīng)