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文檔簡介
1、研究目的:骨折不愈合及骨缺損是臨床骨科醫(yī)生時(shí)常面對的棘手問題。骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一問題帶來了希望。PRP和BMP-2均具有成骨能力,據(jù)報(bào)道相對于單個(gè)生長因子的單次釋放,多種生長因子的聯(lián)合以及有序釋放對于提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化及骨愈合均具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用。
我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪窃O(shè)計(jì)一種組織工程骨,該材料具備三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),負(fù)載PRP和BMP-2,并且能夠精密控制其中生長因子的釋放動(dòng)力學(xué)以適應(yīng)成骨過程各階段對生長
2、因子種類和濃度的不同需求,進(jìn)而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。
研究方法:
1,活體取大鼠股骨骨髓,全骨髓法從骨髓中分離純化出BMSCs并加以傳代擴(kuò)增,并鑒定其干細(xì)胞特征。
2,Landerberg法制備富血小板血漿(PRP)和貧血小板血漿(PPP),ELISA法檢測PRP和PPP中的生長因子濃度。
3,采用復(fù)乳法(W/O/W)制備BMP-2/PLGA微球,電鏡下觀察微球外形;激光粒徑儀檢測微球
3、的粒徑大??;微球內(nèi)BMP-2包封率檢測;BMP-2微球一月內(nèi)生長因子釋放曲線檢測。
4,3D復(fù)合組織工程支架的構(gòu)建,包括支架ⅠBMSCs/PPG;支架ⅡBMSCs/PRG;支架ⅢBMSCs/BMP/PPG;支架ⅣBMSCs/BMP/PRG;支架ⅤBMSCs/BMP-MPs/PPG;支架ⅥBMSCs/BMP-MPs/PRG。3D復(fù)合組織工程支架的電鏡檢測。支架中BMP-2緩釋曲線測量。
5,BMSC在復(fù)合生物支
4、架中的三維培養(yǎng),各復(fù)合組織工程支架中BMSCs增殖及成骨分化能力的檢測。
6,動(dòng)物分為四組,分別為空白對照組(Ⅰ)、PRP+BMSCs組(Ⅱ)、PRP+BMP-2+BMSCs組(Ⅲ)和PRP+BMP-2微球+BMSCs組(Ⅳ),制作大鼠股骨中段骨缺損模型并植入組織工程骨材料。8周后取出股骨標(biāo)本并檢測各組股骨骨痂直徑、生物力學(xué)強(qiáng)度、組織學(xué)檢測。
7,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后得出結(jié)論。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
5、 1,全骨髓法分離純化的BMSCs經(jīng)鑒定為干細(xì)胞,連續(xù)培養(yǎng)8代后干細(xì)胞生物學(xué)性狀無改變,細(xì)胞生長呈典型的干細(xì)胞特征。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后堿性磷酸酶(ALP)染色陽性,茜素紅S染色陽性,VonKossa染色陽性,成軟骨誘導(dǎo)分化后甲苯胺藍(lán)染色陽性,流式細(xì)胞術(shù)檢測成骨細(xì)胞表型和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一致。
2,PRP和PPP經(jīng)激活后呈膠凍狀,電鏡下呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔徑大小為50~100μm,孔徑率為90%。血小板計(jì)數(shù)在PRP中為1.2±0.
6、1×109/ml、在PPP中為8±0.5×106/ml。PRP中TGF-β1含量為450.5±21.4ng/ml。PDGF-AB含量為85.8±13.2ng/ml。
3,采用復(fù)乳法制備的BMP-2微球,平均粒徑為9.86μm,包封率76%,突釋率35%,30天總釋放為83%左右的藥量。
4,在包含PRP的Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ組中,BMSCs的增殖速度明顯快于對照組,而在包含PPP的Ⅲ、Ⅴ組中,BMSCs的增殖速度相對于
7、對照組并不顯著;相對于PRP,BMP-2+PRP聯(lián)合并未能顯著促進(jìn)BMSCs的增殖;相對于BMP-2+PRP,BMP-2/MPs+PRP并未能顯著促進(jìn)BMSCs的增殖。
5,體外培養(yǎng)14天時(shí),BMSCs成骨分化的早期指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)水平在包含BMP-2+PRP的組Ⅳ,Ⅵ達(dá)到最高水平;BMSCs成骨分化的后期指標(biāo)骨橋蛋白(OPN)和骨鈣素(OCN)在包含BMP-2+PRP的組中表達(dá)量高于單獨(dú)包含BMP-2或PRP
8、的組,而其表達(dá)量在BMP-2/MPs+PRP組中最高。
6,制作股骨中段骨缺損模型并植入組織工程骨材料后8周,生物力學(xué)強(qiáng)度、骨折愈合影像學(xué)評(píng)分、骨痂直徑測量及骨痂組織學(xué)評(píng)分均為PRP+BMP-2微球+BMSCs組最高,PRP+BMP-2+BMSCs組次之。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
1,PRP中豐富的復(fù)合生長因子能夠有效刺激BMSCs的增殖;PRP中復(fù)合生長因子和BMP-2協(xié)同釋放能夠有效刺激BMSCs的增殖
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