肝素促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3體外誘導(dǎo)兔牙髓干細(xì)胞成骨向分化能力的研究.pdf

1、目的：應(yīng)用酶解組織塊兒法分離，培養(yǎng)兔牙髓干細(xì)胞的基礎(chǔ)上探討肝素對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor)-β3在體外誘導(dǎo)兔牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)成骨向分化的能力。
　　方法：新西蘭幼兔4只，采用酶解組織塊法分離培養(yǎng)兔DPSCs，傳代培養(yǎng)至第3代兔DPSCs,分別以含0,5u/mL,10u/mL,20u/mL肝素的培養(yǎng)基培養(yǎng)兔DPSCs,繪制生長(zhǎng)曲線，篩選最

2、適濃度的肝素后成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、TGF-β3組，肝素組和TGF-β3+肝素組，空白對(duì)照組正常培養(yǎng),TGF-β3組在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入20μg/L TGF-β3，肝素組在培養(yǎng)基中加入5u/mL肝素，TGF-β3+肝素組在細(xì)胞培養(yǎng)基中同時(shí)加入20μg/L TGF-β3和5 u/mL肝素。各組采用堿性磷酸酶（alkailine phosphate,ALP）試劑盒檢測(cè)兔DPSCs成骨向誘導(dǎo)后第7、14天細(xì)胞內(nèi)ALP活性，細(xì)胞爬片采用免疫

3、細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)成骨細(xì)胞標(biāo)記物RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt related transcription factor2,RUNX-2）和骨鈣素（osteocalcin,OC）表達(dá)情況，采用茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況，對(duì)肝素組行免疫熒光定量PCR檢測(cè)RUNX-2，BSP等成骨相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：通過(guò)酶解組織塊兒法獲取的兔牙髓干細(xì)胞在誘導(dǎo)體系中生長(zhǎng)良好。連續(xù)9天的培養(yǎng)后，肝素對(duì)兔 DPSCs增殖表現(xiàn)為從10

4、u/mL開(kāi)始有明顯的抑制作用，而5u/mL肝素組跟空白對(duì)照組沒(méi)有差異，說(shuō)明5u/mL肝素對(duì)兔DPSCs增殖沒(méi)有抑制作用，即該濃度肝素對(duì)DPSCs沒(méi)有損害性。TGF-β3+肝素組第7,14天 ALP活性[(27.20±1.01),（29.06±1.39）u/mg·pro]明顯高于TGF-β3組[(12.69±1.03),（9.44±1.05）u/mg·pro]和對(duì)照組[(5.96±3.68)、(6.10±3.66)u/mg·pro]（P<

5、0.01），TGF-β3組明顯高于對(duì)照組（P<0.001）；TGF-β3組，肝素組和TGF-β3+肝素組成骨誘導(dǎo)第7天RUNX-2開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，第14天TGF-β3組,TGF-β3+肝素組OC有陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)照組和肝素組為陰性；第21天茜素紅染色對(duì)照組和肝素組為陰性，TGF-β3組為陽(yáng)性，TGF-β3+肝素組為強(qiáng)陽(yáng)性,PCR結(jié)果顯示較對(duì)照組肝素組有RUNX-2 mRNA表達(dá)量上升，而B(niǎo)SP mRNA表達(dá)量沒(méi)有上升。
　　結(jié)論：肝