Lewis肺腺癌全細(xì)胞瘤苗對(duì)C57BL-6小鼠Lewis肺腺癌抑制作用有效性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、問題的提出及研究背景： 人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能表達(dá)腫瘤抗原，機(jī)體的免疫系統(tǒng)通過對(duì)其做出免疫反應(yīng)能將抗原清除。那么機(jī)體罹患腫瘤后能否對(duì)相應(yīng)腫瘤產(chǎn)生特異性免疫?通過提高機(jī)體對(duì)相應(yīng)腫瘤的特異性及非特異性免疫反應(yīng)，能否阻止相應(yīng)腫瘤的復(fù)發(fā)或者再發(fā)?能否確實(shí)地抑制或消退腫瘤，延長無病間期及生存期?這是腫瘤免疫治療中人們所關(guān)心的重要問題。已有的研究結(jié)果多從正面、肯定的角度回答了這一問題。但是對(duì)這類回答的結(jié)果通常與臨床實(shí)際并不吻合，惡性腫瘤的不斷發(fā)

2、展及復(fù)發(fā)是不爭(zhēng)的事實(shí)。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題，試圖通過嚴(yán)密的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來回答上述問題。 對(duì)動(dòng)物模型和腫瘤病人的觀察提示，腫瘤在體內(nèi)的排斥控制主要依賴于腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞。因此，T細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤疫苗理想的效應(yīng)細(xì)胞。腫瘤患者體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞通過T細(xì)胞抗原受體(TCR)與腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的人白細(xì)胞抗原(humanleucocyteantigen，HLA)-抗原肽復(fù)合物的相互作用來識(shí)別其靶分子。HLA-抗原肽復(fù)合物是由蛋白質(zhì)衍生的片

3、段(肽或表位)構(gòu)成，提呈于特異的HLA頂端的槽內(nèi)?？乖耐ǔＪ?到20個(gè)氨基酸的長度，由細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)(抗原)通過加工和切割所形成。參與抗瘤效應(yīng)的T細(xì)胞主要依靠CD4+T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞兩個(gè)亞群。在抗原提呈細(xì)胞的參與下，CD4+T細(xì)胞可識(shí)別瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原，并參與B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)的激活，進(jìn)而發(fā)揮抗瘤作用。CD8+T細(xì)胞的殺傷活性則在機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)中

4、起關(guān)鍵作用。CDS+CTL通過其受體TCR識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)I類分子結(jié)合的腫瘤抗原肽，被激活后增生分化為具有殺瘤活性的CTL殺傷腫瘤細(xì)胞。 腫瘤疫苗治療腫瘤的機(jī)理就在于利用腫瘤抗原激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)，來達(dá)到治療腫瘤的目的。近年來，腫瘤免疫治療被認(rèn)為是非常有吸引力的第四類腫瘤治療方法。尤其在面對(duì)傳統(tǒng)治療方法的許多缺點(diǎn)的時(shí)候，腫瘤免疫治

5、療成為治療腫瘤的新希望。 目前研究者們正深入研究各種不同類型的疫苗，從滅活的全細(xì)胞疫苗到基因修飾腫瘤疫苗、肽和蛋白質(zhì)疫苗及DNA疫苗等。雖然在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中，人們用各種證據(jù)證明了這些疫苗可以引起機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，但是仍然不能阻止腫瘤的惡性進(jìn)展。 因此，腫瘤疫苗及腫瘤免疫的有效性依然是需要再研究的重要問題。我們就這一問題進(jìn)行了探討。我們采用自體腫瘤全細(xì)胞疫苗(包含了腫瘤細(xì)胞表面的所有抗原并且擁有個(gè)體特異性的H

6、LA分子，比異體腫瘤細(xì)胞更安全有效)形式，選用C57BL/6小鼠及來源于C57BL/6小鼠的Lewis肺腺癌細(xì)胞(LewisLungCarcinomalcell，LLC)來進(jìn)行研究。旨在回答自發(fā)性腫瘤能否引起機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)，回答自體腫瘤疫苗作為疫苗的有效性和可行性，為腫瘤細(xì)胞免疫治療的選擇提供依據(jù)。 材料與方法： 一、Lewis肺腺癌細(xì)胞免疫原性的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)分為2部分：二次成瘤實(shí)驗(yàn)及小鼠免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

7、 1.二次成瘤實(shí)驗(yàn)分為2組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各28只小鼠。實(shí)驗(yàn)組小鼠右腋下接種LLC腫瘤細(xì)胞后第12天，將成瘤后的腫瘤切除并制成細(xì)胞懸液，接種于原小鼠的左腋下：同時(shí)將同樣的腫瘤細(xì)胞懸液接種于正常小鼠左腋下，作為對(duì)照組。觀察兩組小鼠的成瘤情況，HE染色觀察瘤組織形態(tài)。 2.小鼠免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為2組：荷瘤組和正常組，每組各10只小鼠。荷瘤組小鼠右腋下接種LLC腫瘤細(xì)胞，正常組小鼠右腋下注射生理鹽水，第12天取外周血

8、及脾臟；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞群比例，MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。 二、Lowis全細(xì)胞瘤苗對(duì)C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究 實(shí)驗(yàn)分為2部分：小鼠免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)及小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。 1.小鼠免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)分為3組：LLC瘤苗組，佐劑對(duì)照組及正常組，每組各10只小鼠。 ①LLC瘤苗組疫苗為滅活的LLC細(xì)胞與完全弗氏佐劑乳化制成，佐劑對(duì)照組疫苗為生理鹽水與完全弗氏佐

9、劑乳化制成，正常組疫苗為生理鹽水。 ②免疫方法：小鼠左前肢及左后肢各肌注疫苗50μl，每周1次，共免疫4次。其中LLC瘤苗組及佐劑對(duì)照組第一次免疫為含弗氏佐劑油劑疫苗，第2、3、4次為滅活LLC細(xì)胞或生理鹽水，正常組4次免疫均為生理鹽水。 ③完成免疫后，三組小鼠均取外周血及脾臟，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中淋巴細(xì)胞亞群比例；血清凝集試驗(yàn)檢測(cè)LLC特異性抗體；雙抗夾心ELISA法檢測(cè)IgG抗體；MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率；

10、臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷率。 2.小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為3組：LLC瘤苗組，佐劑對(duì)照組及正常組，每組各10只小鼠。 ①三組小鼠均予疫苗免疫，疫苗及免疫方法同前。 ②在第4次免疫的同時(shí)，三組小鼠均于右腋下接種LLC活細(xì)胞，觀察成瘤率、成瘤時(shí)間及生存期；取腫瘤組織及接種疫苗局部組織行HE染色，觀察其形態(tài)學(xué)變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、Lewis肺腺癌細(xì)胞的免疫原性 1.實(shí)驗(yàn)組C57小鼠第一

11、次右腋下皮下接種Lewis肺腺癌細(xì)胞，成瘤率為100％，手術(shù)切除腫瘤后于對(duì)側(cè)皮下第二次接種Lewis肺腺癌細(xì)胞，成瘤率為89.3％，與第一次接種及對(duì)照組的成瘤率(100％)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.236)；實(shí)驗(yàn)組小鼠右腋下腫瘤切除后復(fù)發(fā)率為96.4％。與第一次接種成瘤率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.313)： 2.HE染色顯示小鼠第一次及第二次成瘤的瘤組織形態(tài)無明顯差異，第一及第二次成瘤的瘤組織內(nèi)均未見明顯淋巴細(xì)胞浸潤及

12、纖維組織增生； 3.荷瘤組與正常組相比，其外周血中CD4+、CD8+、CD19+淋巴細(xì)胞亞群的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 4.荷瘤組與正常組相比，其脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率相近，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 二、Lewis細(xì)胞瘤苗對(duì)C57BL/6小鼠Lewis肺癌抑制作用 1.LLC瘤苗組、佐劑對(duì)照組、正常組小鼠成瘤率均為100％。LLC瘤苗組、佐劑對(duì)照組、正常組小鼠成瘤時(shí)間分別為8.7天、8.

13、1天、7.3天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030)。其中兩兩比較LLC瘤苗組與佐劑對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.693)，LLC瘤苗組與正常組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。LLC瘤苗組、佐劑對(duì)照組及正常組小鼠中位生存時(shí)間分別為33、33、36天，三者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.254)： 2.HE染色顯示LLC疫苗組、佐劑對(duì)照組及正常組免疫后接種LLC細(xì)胞，其成瘤瘤組織形態(tài)無明顯差異，瘤組織內(nèi)均未見明顯淋巴細(xì)胞

14、浸潤；LLC疫苗組及佐劑對(duì)照組接種疫苗局部組織均可見結(jié)締組織水腫、粘液樣變性、纖維素性變性，少量淋巴細(xì)胞浸潤，并普遍出現(xiàn)淋巴管樣結(jié)構(gòu)。 3.三組小鼠比較，外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CD4+/CD8+比值差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：三組小鼠CD19+B細(xì)胞百分比中正常組最高，其次為LLC瘤苗組，佐劑對(duì)照組外周血CD19+B細(xì)胞百分比最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，但兩兩比較LLC瘤苗組與佐劑

15、對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.251)。 4.LLC瘤苗組和佐劑對(duì)照組及正常組小鼠血清分別與滅活LLC細(xì)胞混合后，混合物為淡黃色，清亮，未見流沙樣凝集物出現(xiàn)，結(jié)果均為陰性。 5.LLC瘤苗組和佐劑對(duì)照組及正常組小鼠血清IgG抗體濃度分別為28.82ng/ml、21.43ng/ml、23.32ng/ml.其中LLC瘤苗組小鼠血清IgG抗體濃度最高，其次為正常組小鼠血清IgG抗體濃度，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.165

16、)。 6.三組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063)，LLC瘤苗組和佐劑對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均略高于正常組小鼠；LLC疫苗組和佐劑對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率接近； 7.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三組小鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞的殺傷率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.535)；三組小鼠細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)782細(xì)胞殺傷率差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.931)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞與782細(xì)胞殺傷率比較，差異

17、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.241)。 結(jié)論： 一、Lewis肺腺癌細(xì)胞對(duì)于C57BL/6小鼠為低免疫原性腫瘤細(xì)胞株。至少存在機(jī)體對(duì)同種屬低免疫原性腫瘤細(xì)胞不產(chǎn)生免疫識(shí)別，所以再次遇到相同腫瘤細(xì)胞時(shí)不能產(chǎn)生有效的免疫殺傷或免疫抑制作用。 二、添加完全弗氏佐劑的Lewis肺腺癌全細(xì)胞瘤苗不能增強(qiáng)C57BL/6小鼠的特異性和非特異性免疫功能，也不能使小鼠獲得有效的免疫保護(hù)。這提示對(duì)于同種屬低免疫原性腫瘤細(xì)胞，即便添加佐劑，