自體起搏細(xì)胞移植構(gòu)建生物心臟起搏器的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 生物心臟起搏器(Biological Cardiac Pacemaker)是心臟起搏治療領(lǐng)域的未來發(fā)展方向。其原理是利用細(xì)胞技術(shù)與基因治療技術(shù),將起搏基因?qū)敕瞧鸩?xì)胞,構(gòu)建一種“人造”的起搏細(xì)胞,然后植入體內(nèi)使其發(fā)揮其起搏心室提高心率的作用。擬通過生物心臟起搏器的構(gòu)建,探索治療緩慢型心律失常類疾病的新方法,以克服電子心臟起搏器的缺點(diǎn),最終達(dá)到使此類患者免除電子心臟起搏器植入的目的。 本課題在我單位對骨髓干細(xì)胞的

2、長期研究基礎(chǔ)上,結(jié)合國內(nèi)外關(guān)于生物起搏研究的最新進(jìn)展,分以下3個(gè)階段對自體生物心臟起搏器的構(gòu)建進(jìn)行探索。 1.明確細(xì)胞移植技術(shù)構(gòu)建自體生物心臟起搏的可行性：應(yīng)用犬竇房結(jié)細(xì)胞進(jìn)行自體心室肌內(nèi)移植,探索自體起搏細(xì)胞移植治療緩慢型心律失常類疾病的作用和效果,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)摸索和建立相關(guān)技術(shù)、實(shí)驗(yàn)條件以及評價(jià)方法,并提供可行性分析； 2.構(gòu)建自體起搏細(xì)胞：利用攜帶hHCN2基因的重組腺病毒載體(Ad.hHCN2),將hHCN2基因?qū)?/p>

3、入犬骨髓干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)以構(gòu)建具有生理性起搏功能的起搏細(xì)胞(Ad.hHCN2-MSCs); 3.研究自體起搏細(xì)胞體內(nèi)移植起搏心室的效果：將構(gòu)建好的起搏細(xì)胞(Ad.hHCN2-MSCs),通過細(xì)胞移植技術(shù)移植到完全性房室傳導(dǎo)阻滯后的犬自體心室肌內(nèi),構(gòu)建自體生物心臟起搏器,評價(jià)其起搏心室的作用和效果。 方法： 1.手術(shù)獲取竇房結(jié)后,通過多種酶的聯(lián)合消化技術(shù)分離獲得竇房結(jié)

4、細(xì)胞,選擇單個(gè)自主搏動的竇房結(jié)細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗研究,研究其起搏電流、動作電位等電生理學(xué)參數(shù)。 2.將竇房結(jié)細(xì)胞懸液斜行注入鈦夾標(biāo)記處右心室前壁心外膜下,并在該處心外膜進(jìn)行標(biāo)記。 3.細(xì)胞移植后兩周后,射頻消融希氏束或房室結(jié)建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯動物模型,并通過心臟電生理檢查、移植部位的細(xì)胞學(xué)檢查、免疫熒光染色等技術(shù)和方法,對竇房結(jié)細(xì)胞自體移植后起搏心室的效果進(jìn)行評價(jià)。 4.通過構(gòu)建Ad.hHCN2重組腺病毒,將hH

5、CN2基因?qū)肴撬韪杉?xì)胞(MSCs)。待其在MSCs穩(wěn)定表達(dá)后,利用膜片鉗技術(shù)對表達(dá)HCN2通道蛋白的MSCs進(jìn)行電生理學(xué)研究,評價(jià)其起搏功能,并進(jìn)一步優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染方法。通過MSCs與乳鼠心肌細(xì)胞的體外聯(lián)合培養(yǎng),研究構(gòu)建的起搏細(xì)胞在體外對心肌細(xì)胞的起搏效果。 5.建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯的犬模型,然后將體外構(gòu)建好的自體起搏細(xì)胞(Ad.hHCN2轉(zhuǎn)染的犬骨髓干細(xì)胞)自體移植到心室肌內(nèi),通過采用體表心電圖、24小時(shí)動態(tài)心電圖、組織病

6、理學(xué)技術(shù)、免疫熒光組織化學(xué)染色等多種檢測手段綜合評價(jià)其起搏心室的作用和效果,并研究這種生物起搏心律對于神經(jīng)體液調(diào)節(jié)的反應(yīng)能力。 結(jié)果： 1.酶消化法分離獲得的犬竇房結(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能保持完整,能夠產(chǎn)生典型的起搏電流,并在體外自主搏動。 2.將分離獲得的竇房結(jié)細(xì)胞自體移植到完全性房室傳導(dǎo)阻滯后的心室肌內(nèi),能夠有效起搏心室,經(jīng)神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)性研究證實(shí),這種異位起搏心律對異丙腎上腺素具有良好的反應(yīng)性。 3.對細(xì)胞移

7、植部位的心室肌標(biāo)本進(jìn)行分離,證實(shí)移植的竇房結(jié)細(xì)胞能夠在移植部位存活,同時(shí)也與心室肌細(xì)胞形成了功能性的縫隙連接結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí),移植細(xì)胞之間以及移植細(xì)胞與原有心室肌細(xì)胞之間均有縫隙連接蛋白表達(dá),提示細(xì)胞間形成了電-機(jī)械耦聯(lián)。 4.Ad.hHCN2轉(zhuǎn)染犬骨髓干細(xì)胞后,其轉(zhuǎn)染效率約為70％,細(xì)胞狀態(tài)良好。對轉(zhuǎn)染后的MSCs進(jìn)行膜片鉗研究,可以記錄到具有超極化電壓激活以及時(shí)間依賴性特點(diǎn)的起搏電流,并且這種電流隨電壓的遞增

8、而不斷增強(qiáng),在超極化鉗制電壓為-105mV時(shí)完全激活,峰電流強(qiáng)度約為-400 pA,并具有起搏電流的典型特性。與乳鼠心肌細(xì)胞的體外聯(lián)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明,我們構(gòu)建的起搏細(xì)胞能夠提高乳鼠心肌細(xì)胞的搏動頻率,表明其在體外環(huán)境下具有起搏功能。 5.自體起搏細(xì)胞體內(nèi)移植后第2周起,體表心電圖檢查提示移植組犬出現(xiàn)起源于細(xì)胞移植部位的室性自主心律。心室超速起搏實(shí)驗(yàn)提示實(shí)驗(yàn)組犬的室性自主心律的激動點(diǎn)比對照組具有更高的興奮性。24小時(shí)動態(tài)心電圖監(jiān)測表

9、明,從第2周起無突發(fā)或嚴(yán)重的心律不齊或紊亂。利用Holter計(jì)算機(jī)軟件分析所得的實(shí)驗(yàn)組犬的平均心率、總心搏次數(shù)、生物起搏次數(shù)及生物起搏率等參數(shù)均優(yōu)于對照組,并且這種心律對腎上腺素具有良好的反應(yīng)性。免疫熒光組織化學(xué)研究提示自體移植的MSCs細(xì)胞能夠在移植部位存活,并有效表達(dá)HCN2通道蛋白。 結(jié)論： 1、通過體外消化分離得到的竇房結(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能保持完整,且移植到自體心室肌后,能有效提高心室率,并對神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)具有良好反

10、應(yīng)性。 2、利用基因技術(shù)構(gòu)建攜帶起搏基因的重組腺病毒載體,轉(zhuǎn)染體外傳代培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞后,經(jīng)膜片鉗技術(shù)和細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種構(gòu)建的起搏細(xì)胞在體外環(huán)境下具有起搏功能。 3、將構(gòu)建好的起搏細(xì)胞自體移植到完全性房室傳導(dǎo)阻滯犬心室肌后,能有效起搏心室并提高室性節(jié)律,發(fā)揮其作為生物心臟起搏器的作用,并且這種生物起搏心律具有良好的自動調(diào)節(jié)能力。 4、自體生物心臟起搏器雖然能夠提高完全性房室傳導(dǎo)阻滯后的心室率,但這種生物起