立體定向注射依達拉奉對腦出血大鼠免疫炎癥反應和凋亡的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種起病急、進展快、嚴重危及生命的神經(jīng)科疾病，其發(fā)病率和急性期病死率高，有較高的復發(fā)率，大多遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如偏癱和失語等。不僅使患者的生活質(zhì)量下降，同時也給社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。因此，對ICH的防治有十分重要的意義，尤其保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，減少神經(jīng)損傷所致的后遺癥更具臨床實用性，但目前尚無理想的內(nèi)科及外科治療方法。ICH急性期的治療對疾病轉(zhuǎn)歸影響極大

2、，常規(guī)治療局限在脫水、降低顱內(nèi)壓、維持生命體征、對癥支持治療、止血和外科手術(shù)治療等。
　　依達拉奉是一種強效自由基清除劑，能抑制腦水腫，改善神經(jīng)功能，緩解伴隨的神經(jīng)癥狀。臨床上已廣泛應用于治療缺血性中風，并取得了較好的療效。依達拉奉可改善缺血腦組織的功能和局部組織結(jié)構(gòu)。大鼠局灶性腦缺血實驗表明，依達拉奉可減少缺血和再灌注后腦組織內(nèi)NO的生成，顯著改善神經(jīng)功能廢損癥狀和減少缺血面積。缺血和出血均可造成局部腦組織氧供減少，引起神經(jīng)組織

3、損傷。ICH引發(fā)的病理過程和缺血類似但又不完全相同，二者均可產(chǎn)生大量的自由基，誘發(fā)炎癥因子風暴，激活巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞等，促進神經(jīng)細胞的凋亡。在大鼠和小鼠腦出血模型中均證實依達拉奉可減少腦出血所致的神經(jīng)細胞凋亡，減輕腦出血后的神經(jīng)損傷和腦水腫，改善腦組織代謝。但目前有關(guān)依達拉奉治療ICH的相關(guān)研究和機制的探索遠少于對缺血性腦梗死的報道，具體的分子調(diào)控機制和網(wǎng)絡(luò)尚不清楚，因此，依達拉奉對ICH的臨床療效和作用機理需要更為深入的研究。

4、r>　　依達拉奉有多種給藥方式，不同的給藥途徑影響著藥效的發(fā)揮，如何快速提高靶位的藥物濃度是提高療效的關(guān)鍵。目前，臨床主要采用靜脈注射或滴注的方式給藥，腹腔給藥主要應用于動物模型研究，顱內(nèi)局部給藥的方式還未見報道。腹腔給藥需經(jīng)過腸系膜吸收后才能入血，這一過程會導致藥物的損耗，使進入血液的藥物減少。靜脈輸液和動脈推注，可不經(jīng)腸壁和肝臟直接進入體循環(huán)，比腹腔給藥途徑可獲得更快更高的血藥濃度。但藥物必須通過全身血液循環(huán)后才能最終到達病變部位，

5、這種途徑給予的藥物是全身分布的，真正作用于病變部位的藥物僅占所給藥物的小部分。而且高濃度的依達拉奉隨血流可分部到全身的任何組織，因此也增加了發(fā)生不良反應的機率。另外，靜脈注射同時受到穿刺的局限，部分患者的靜脈不易尋找，特別是肥胖病人更加困難。鑒于此，需要尋找一種更有效的給藥途徑以提高療效，減少副作用。立體定向給藥目前被認為是一種較好的給藥方式，特別適于顱內(nèi)少量出血進行立體定向微創(chuàng)手術(shù)治療或保守治療需要局部給藥的病人，它避免了經(jīng)血的長時間

6、長距離的運送，也不用再受血腦屏障的影響。立體定向給藥是否優(yōu)于其它的給藥途徑？經(jīng)立體定向給藥的依達拉奉通過什么機制改善神經(jīng)功能？這些都是本文需要解決的問題。
　　目的：
　　(1)觀察立體定向注射依達拉奉對腦出血大鼠的神經(jīng)保護作用。
　　(2)觀察立體定向注射依達拉奉對免疫炎癥反應和細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。
　　(3)對比不同給藥途徑的依達拉奉療效差異。
　　方法：
　　第一部分 立體定向注射依達拉奉對腦出

7、血大鼠的神經(jīng)保護作用
　　實驗建模和分組:
　　本研究選用201只體重在250-280g的成年SD大鼠（雄性），利用注射Ⅶ型膠原酶的方法構(gòu)建ICH大鼠模型。實驗分為四組:假手術(shù)組，ICH生理鹽水立體定向?qū)φ战M，依達拉奉腹腔給藥組，依達拉奉立體定向給藥組。生理鹽水立體定向?qū)φ战M:出血灶形成后24 h、72 h，立體定向注入血腫腔10μL生理鹽水。腹腔給藥組:出血灶形成后1h、24 h，48 h，72 h腹腔注射3 mg/kg的

8、依達拉奉。立體定向給藥組:出血灶形成后24 h、72 h立體定向注入血腫腔10μL，1.5 mg/ml的依達拉奉。
　　評價指標:
　　(1)神經(jīng)功能評估:對四組大鼠在不同時間點進行神經(jīng)行為學評分(mNSS評分);(2腦出血損傷范圍:MRI掃描后三維重建計算血腫體積和出血側(cè)的腦室體積用以評價損傷程度;HE染色評價腦損傷形態(tài)學，(3)神經(jīng)纖維再生:快藍染色及NF200免疫熒光染色觀察髓鞘再生及軸突再生;(4)膠質(zhì)瘢痕形成:采用

9、GFAP免疫熒光染色觀察膠質(zhì)瘢痕的形成。
　　統(tǒng)計學分析:
　　所有數(shù)值型原始數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(SD)表示，組間差異采用單因素方差分析進行統(tǒng)計。造模后各組大鼠各時間點的數(shù)據(jù)比較用重復測量的廣義線性模型分析，單個時間點間數(shù)據(jù)比較用one-way ANOVA分析，組間的多重比較采用Bonferroni進行多重檢驗校正。均為雙側(cè)檢驗，α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義的判斷標準。所有統(tǒng)計均使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件

10、處理，采用prism6.0進行繪圖。
　　第二部分 立體定向注射依達拉奉對腦出血大鼠炎癥水腫反應和細胞凋亡的調(diào)節(jié)實驗分組和建模:
　　同第一部分。
　　評價指標:
　　(1)炎癥水腫反應:1）腦水腫反應:檢測腦組織干濕重比;2）血腦屏障破壞程度:伊文思藍染色(Evans Blue)和透射電鏡觀察;3）小膠質(zhì)細胞極化現(xiàn)象:熒光雙標記物染色(iNOS/CD11b、Arginase-1/CD11b)，同時用WB從蛋白水

11、平進一步驗證小膠質(zhì)細胞向M1和M2的分化程度;4）炎癥因子表達:ELISA定量檢測腦組織中炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-10)的表達水平。
　　(2)細胞凋亡的研究:1）檢測MDA含量，以缺口末端標記法(TUNEL法)檢測神經(jīng)細胞凋亡數(shù);2）免疫熒光染色分析Caspase-3、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達變化。
　　統(tǒng)計學分析:
　　同第一部分。
　　結(jié)果：
　　1.依達拉奉治療組（依

12、達拉奉立體定向給藥組和依達拉奉腹腔給藥組）的行為學評分在1.5天后顯著低于生理鹽水立體定向?qū)φ战M(P＜0.05)，而且依達拉奉立體定向給藥組的行為學評分在給藥7天后顯著低于依達拉奉腹腔給藥組（P＜0.05）。
　　2.依達拉奉治療組腦出血MRI顯示第28天依達拉奉立體定向治療組損傷的腦組織體積顯著小于腹腔注射組和生理鹽水對照組（P＜0.05）。ICH出血灶HE染色顯示第7天和第14天時，依達拉奉立體定向治療組出血灶體積相比于立體定

13、向鹽水對照組與依達拉奉腹腔注射治療組有明顯的縮小趨勢。
　　3.依達拉奉治療組神經(jīng)髓鞘(Fast Blue)染色及神經(jīng)軸突NF200免疫熒光染色顯示依達拉奉立體定向給藥組與鹽水立體定向組和腹腔給藥組相比，7天和14天髓鞘缺失面積明顯減小(P＜0.05)，NF200表達顯著增高(P＜0.05)。神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕GFAP免疫熒光染色顯示，依達拉奉立體定向給藥組與其它兩組比，GFAP表達顯著降低(P＜0.05)。
　　4.依達拉奉治療

14、組血腦屏障通透性（伊文思藍染色）和干濕重比在5天時均顯著優(yōu)于和小于生理鹽水立體定向?qū)φ战M(P＜0.05），依達拉奉立體定向給藥組和依達拉奉腹腔給藥組兩組間也存在顯著性差異(P＜0.05）。透射電鏡觀察血腦屏障星形細胞足突顯示依達拉奉治療組在ICH第14、28天水腫顯著小于其它兩組。
　　5.小膠質(zhì)細胞分型標志物熒光染色顯示Arginase-1標記物（抑炎M2型）高表達，iNOS標記物（促炎M1型）低表達;WB相對定量實驗顯示第7和

15、14天時，依達拉奉治療組與生理鹽水立體定向?qū)φ战M相比，Arginase-1表達顯著升高，iNOS表達顯著降低(P＜0.05)。
　　6.依達拉奉治療組(依達拉奉立體定向給藥組和依達拉奉腹腔給藥組)TNF-α和IL-1β表達量顯著低于生理鹽水立體定向?qū)φ战M(P＜0.05），IL-4和IL-10表達量顯著高于鹽水立體定向?qū)φ战M(P＜0.05)。與依達拉奉腹腔給藥組相比，依達拉奉立體定向給藥組的TNF-α和IL-1β表達量顯著降低，IL

16、-4和IL-10表達量顯著升高(P＜0.05）。
　　7.在第7天時，依達拉奉治療組Caspase-3蛋白表達下調(diào)，Bcl-2蛋白表達上調(diào)，細胞凋亡計數(shù)顯著低于生理鹽水立體定向?qū)φ战M(P＜0.05）。
　　8.依達拉奉立體定向注射過程中未觀察到有大鼠死亡，也沒有抽搐、感染等其它并發(fā)癥發(fā)生。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)依達拉奉立體定向局部給藥途徑治療效果顯著好于腹腔注射給藥途徑的治療效果。立體定向注射依達拉奉可顯著