前列腺癌多藥耐藥細(xì)胞中PDLIM4基因表達(dá)上調(diào)機(jī)制分析.pdf

1、隨著我國(guó)老齡化趨勢(shì)的加快，以及生活環(huán)境、飲食習(xí)慣等改變，前列腺癌(prostatecancer，PCa)作為老年男性惡性腫瘤，其發(fā)病率日趨增長(zhǎng)，且中晚期患者的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于國(guó)外，已成為嚴(yán)重威脅男性健康的社會(huì)問題。PCa作為激素依賴性腫瘤，其細(xì)胞增殖主要受雄激素/雄激素受體(Androgenreceptor，AR)信號(hào)途徑調(diào)節(jié)，因此內(nèi)分泌治療是治療中晚期PCa的首選方法。但絕大多數(shù)對(duì)內(nèi)分泌治療敏感的PCa患者在治療后1年左右復(fù)發(fā)，發(fā)展成為激

2、素難治性前列腺癌(Hormonerefractoryprostatecancer，HRPC)，大約超過半數(shù)以上的HRPC患者會(huì)有骨骼和軟組織轉(zhuǎn)移，死亡率高。由于HRPC的病理機(jī)制復(fù)雜、且不完全清楚，臨床缺乏有效的治療策略，化療仍是目前主要的治療手段之一。與米托司酮等僅緩解患者臨床癥狀的藥物相比，以多西紫杉醇(Docetaxel，Doc)為基礎(chǔ)的化療方案，是已被證實(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)HRPC患者生存期的藥物，然而約50％的轉(zhuǎn)移性HRPC患者對(duì)多西

3、紫杉醇不敏感，或藥物治療后產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性反應(yīng)，病情惡性發(fā)展。因此，深入細(xì)致的理解HRPC演變的“內(nèi)在性機(jī)制”以及對(duì)Doc產(chǎn)生耐藥性的“獲得性機(jī)制”，一直是研究者極為關(guān)注的課題。本課題組前期已通過Doc誘導(dǎo)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞PC3細(xì)胞、構(gòu)建多藥耐藥細(xì)胞PC3/Doc，基因表達(dá)差異譜芯片結(jié)果顯示，除了經(jīng)典的耐藥基因、抗凋亡基因表達(dá)上調(diào)外，一些轉(zhuǎn)錄因子、癌基因、抑癌基因等也存在不同程度的變化。由于癌基因、抑癌基因的異常表達(dá)也是形成多藥耐藥

4、的機(jī)制之一，本論文初步探討芯片中表達(dá)顯著上調(diào)的抑癌基因PDLIM4的調(diào)控機(jī)制。
　　 PDLIM4基因，又稱RIL(reversion-inducedLIMgene)，是定位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂上31.1的基因，編碼含PDZ和LIM區(qū)域的蛋白，目前報(bào)道該基因?qū)儆谝职┗?，其功能研究尚不多。在前列腺癌中，PDLIM4基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化，導(dǎo)致該基因表達(dá)沉默，其中的具體機(jī)制并不清楚。DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)的范疇，是基因組DNA的一種

5、主要表觀遺傳修飾形式，是調(diào)節(jié)生物功能的重要手段，DNA甲基化修飾并不改變基因序列。DNA甲基化過程主要是通過三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1，DNMT3A，DNMT3B完成的。通常發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域（例如基因啟動(dòng)子區(qū)域）的DNA甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄失活，抑癌基因的表達(dá)沉默易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。由于DNA甲基化是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，通過DNA甲基化酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Az

6、a)逆轉(zhuǎn)調(diào)控區(qū)域的甲基化可使沉默的基因恢復(fù)表達(dá)。
　　 我們對(duì)激素依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3及其構(gòu)建的多西紫杉醇耐藥細(xì)胞株P(guān)C3/Doc進(jìn)行了表達(dá)譜芯片分析，其中PDLIM4在耐藥細(xì)胞株中呈現(xiàn)高表達(dá)。我們首次報(bào)道了PDLIM4基因在前列腺癌耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)，并對(duì)PDLIM4基因在前列腺癌耐藥細(xì)胞株中高表達(dá)機(jī)制進(jìn)行了分析，并對(duì)PDLIM4基因與前列腺癌耐藥的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，分析PDLIM4是否可以成為耐藥前列腺癌治療的新靶點(diǎn)

7、。
　　 目的:
　　 探討PDLIM4基因在前列腺癌中表達(dá)，以及PDLIM4基因在耐藥細(xì)胞株P(guān)C3/Doc、K562/A02中的作用。
　　 方法:
　　 1.PDLIM4在前列腺癌及其它細(xì)胞利用定量PCR、Westernblot、免疫熒光等方法檢測(cè)PDLIM4在前列腺癌細(xì)胞株及其他細(xì)胞株（K562等）中的表達(dá)情況;
　　 2.利用Westernblot和DNA甲基化酶活檢測(cè)等方法比較PC3和P

8、C3/Doc在DNMTs方面的差異;
　　 3.利用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測(cè)PDLIM4啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況;
　　 4.利用RNA干擾技術(shù)分析PDLIM4基因在耐藥細(xì)胞株P(guān)C3/Doc中的作用。
　　 5.利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染檢測(cè)DNA甲基化結(jié)合蛋白MBD2對(duì)PDLIM4表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 一.PDLIM4在耐藥細(xì)胞株中的高表達(dá)具有組織特異性
　　 1.檢測(cè)前列腺細(xì)胞株

9、中PDLIM4的表達(dá)
　　 PDLIM4基因在RWPE1細(xì)胞株中高表達(dá)，在DU145、LNCaP細(xì)胞株中低表達(dá)或者無(wú)表達(dá)。在前列腺癌PC3細(xì)胞中表達(dá)甚低，而在與其對(duì)應(yīng)的多藥耐藥PC3/Doc細(xì)胞中高表達(dá)（P＜0.05)。PDLIM4隨著PC-3/Doc細(xì)胞耐藥倍數(shù)的增加，其mRNA水平、蛋白表達(dá)均逐漸升高(P＜0.05)。
　　 2.檢測(cè)PDLIM4在其他耐藥細(xì)胞株中的表達(dá)
　　 PDLIM4在K562及其耐藥細(xì)

10、胞株K562/A02中均有表達(dá)，但在耐藥細(xì)胞K562/A02中的表達(dá)低于其敏感細(xì)胞。而H460及其耐藥細(xì)胞株H460/Doc中均未檢測(cè)到PDLIM4的表達(dá)。
　　 二.DNMTs影響PDLIM4的表達(dá)，但不是唯一因素
　　 1.檢測(cè)前列腺細(xì)胞株中DNMTs的表達(dá)
　　 PDLIM4在正常上皮RWPE1細(xì)胞中高表達(dá)，而DNMT1、3A、3B表達(dá)量相對(duì)較低
　　 2.PC3細(xì)胞株用5-Aza處理后，在mRNA

11、水平PDLIM4表達(dá)上調(diào)并不明顯;而5-Aza處理LNCaP細(xì)胞株后，PDLIM4上調(diào)明顯。
　　 3.PC3與PC3/Doc在DNMTs表達(dá)水平上無(wú)明顯差別，但在耐藥細(xì)胞株P(guān)C3/Doc中DNMTs的活性降低。
　　 4.與PC3相比，PC3/Doc中PDLIM4啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度降低。
　　 5.PC3/Doc中的甲基化DNA結(jié)合蛋白MBD2不表達(dá)，通過過表達(dá)MBD2并不影響PDLIM4的表達(dá)。