膿毒癥性急性肺損傷大鼠細(xì)胞因子調(diào)控變化及復(fù)方清下湯對(duì)其影響.pdf

1、背景及目的：膿毒癥多繼發(fā)于嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克和大手術(shù)后，是由于局部或全身感染等因素所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS）。發(fā)展到晚期的膿毒性休克和多器官功能障礙綜合征（MODS）是該癥的主要死亡原因，也是臨床上危重病中最常見的死亡原因。膿毒癥病情進(jìn)展迅速，是臨床醫(yī)學(xué)中一種難治的綜合征。目前關(guān)于膿毒癥的研究多集中于對(duì)某些臟器以及對(duì)不同時(shí)期各種炎性因子的研究。 膿毒癥在創(chuàng)傷和感染等應(yīng)激狀態(tài)下，腸道的屏障功能受損，腸道內(nèi)大量的細(xì)菌和

2、內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈及淋巴系統(tǒng)侵入血液循環(huán)，造成腸源性感染和毒性網(wǎng)絡(luò)，引起全身多器官功能衰竭。急性肺損傷（ALI）發(fā)生早、病情嚴(yán)重，常是病人死亡的直接原因。ALI是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其嚴(yán)重階段即是急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）； ARDS是多種原因引起的肺部失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，而革蘭氏陰性桿菌內(nèi)毒素（LPS）介導(dǎo)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生釋放大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在ARDS的發(fā)病過程中起關(guān)鍵性作用，但ARDS發(fā)病機(jī)制尤其是肺水腫的形成

3、機(jī)制仍未闡明清楚。 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）、水通道蛋白（AQPs）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等諸因素均可能與水腫的發(fā)生有關(guān)，但是其內(nèi)在相互關(guān)系及調(diào)控并不完全清楚。 腫瘤壞死因子（TNF），包括TNF-α和TNF-β。TNF-α又稱為惡液質(zhì)因子，是介導(dǎo)內(nèi)毒素休克、SIRS、急性肺損傷（ALI）和多器官功能障礙綜合征（MODS）

4、的重要起始因子，可誘導(dǎo)其它多種因子的產(chǎn)生，這些促炎癥細(xì)胞因子之間相互作用可形成許多正反饋環(huán)，導(dǎo)致所謂炎癥“級(jí)聯(lián)效應(yīng)”的發(fā)生。 細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）又名CD54。研究發(fā)現(xiàn)其參與許多炎癥性疾病過程。其可能介導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，多形核粒細(xì)胞（PMVEC-PMN）的粘附，導(dǎo)致PMN肺微血管內(nèi)的扣押，微血栓形成和血管內(nèi)皮損傷，引起血管通透性增加，形成肺水腫，進(jìn)而導(dǎo)致ALI。 水通道蛋白（AQPs），其主要功能是介導(dǎo)自

5、由水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。肺組織中主要有4種水通道蛋白的表達(dá)，其中AQP-1主要定位于肺微血管內(nèi)皮，對(duì)于維持血管與間質(zhì)之間的水運(yùn)動(dòng)平衡意義重大。 MAPK是蛋白激酶家族成員，其中p38通路與炎癥反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān)，在許多細(xì)胞因子如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。研究顯示p38可促進(jìn)ICAM-1的表達(dá)。p38可由TNF-α、IL-1等誘導(dǎo)刺激而激活，而TNF-α、IL-1、IL-6以及IL-8又是p38依賴性的。 膿毒癥過程所引起的急性

6、肺損傷（ALI）與上述基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)性研究較少，并且未見在同一感染模型下對(duì)上述基因表達(dá)調(diào)控的平行研究，亦未見復(fù)方清下湯的相關(guān)治療性研究的報(bào)道。本課題擬以盲腸結(jié)扎穿孔導(dǎo)致大腸桿菌腹膜炎，進(jìn)而誘發(fā)膿毒癥肺損傷為模型，檢測(cè)炎性反應(yīng)時(shí)上述基因的調(diào)控變化，探討肺水腫的形成機(jī)制，調(diào)控機(jī)制及復(fù)方清下湯、p38抑制劑對(duì)肺損傷的作用，以期為膿毒癥以及多器官功能衰竭綜合癥（MODS）的防治提出可能的新途徑。 方法: 實(shí)驗(yàn)一：將健康SD大

7、鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：假手術(shù)組（SHAM組），SHAM組只翻動(dòng)盲腸，不做其他處理；膿毒癥肺損傷組（模型組），以盲腸結(jié)扎穿孔誘發(fā)ALI模型；盲腸結(jié)扎穿孔+復(fù)方清下湯組（造模后立即灌胃給藥，造模后8小時(shí)再次灌胃1次，劑量：10 ml/kg）；盲腸結(jié)扎穿孔+頭孢派酮舒巴坦組（抗生素舒普深）（造模后立即靜脈注射1次，造模后8小時(shí)再次靜脈注射1次，劑量：0.2g/kg）造模24h后收集標(biāo)本。分別觀察大鼠的一般狀態(tài)，肺組織勻漿MPO的測(cè)定，留

8、取下腔靜脈血清進(jìn)行TNF-α、IL-1、IL-6的測(cè)定。鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)改變，測(cè)量肺濕/干比值的變化。 實(shí)驗(yàn)二：將健康SD大鼠隨即分為4組，每組10只：（1）假手術(shù)組（SHAM組），SHAM組只翻動(dòng)盲腸，不做其他處理；（2）膿毒癥肺損傷組（模型組），以盲腸結(jié)扎穿孔誘發(fā)ALI模型；（3）盲腸結(jié)扎穿孔+復(fù)方清下湯組（造模后立即灌胃給藥，造模后8小時(shí)再次灌胃1次，劑量：10 ml/kg）；（4）盲腸結(jié)扎穿孔+頭孢派酮舒巴坦（抗

9、生素舒普深）（造模后立即靜脈注射1次，造模后8小時(shí)再次靜脈注射1次，劑量：0.2 g/kg）造模24h后收集標(biāo)本。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和western blot方法檢測(cè)肺組織中TNF-α、 IL-1、 IL-6、AQP-1、ICAM-1以及p38的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)肺組織上述蛋白mRNA表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)三：將健康SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：（1）假手術(shù)組（SHAM組），SHAM組只翻動(dòng)盲腸，不做其他處理；（2）膿毒癥肺損傷組

10、（模型組），以盲腸結(jié)扎穿孔誘發(fā)ALI模型；（3）盲腸結(jié)扎穿孔+復(fù)方清下湯組（造模后立即灌胃給藥，造模后8小時(shí)再次灌胃1次，劑量：10 ml/kg）；（4）p38抑制劑處理組，在動(dòng)物模型組制備前30分鐘灌胃給予SB203580（12.5 mg/kg）。應(yīng)用免疫組織化學(xué)和western blot法方法檢測(cè)肺組織中TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1的表達(dá)。采用RT-PCR法檢測(cè)肺組織上述蛋白mRNA表達(dá)。 結(jié)果: 1

11、.實(shí)驗(yàn)一：與SHAM組比較，模型組MPO、TNF-α、IL-1、IL-6水平明顯升高，肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)水腫，伴大量紅細(xì)胞滲出（出血）和纖維素沉積，肺泡間隔毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞高度腫脹。肺濕/干比值明顯增加，抗生素及中藥處理組與模型組比較，MPO、TNF-α、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）水平明顯降低，肺濕/干比值明顯降低，肺組織鏡下表現(xiàn)：抗生素處理組、中藥處理組較模型組，肺泡間隔變窄，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹減輕，出血明顯減少，纖

12、維素滲出相對(duì)減少。 2.實(shí)驗(yàn)二：與SHAM組比較，模型組應(yīng)用免疫組織化學(xué)及western blot法檢測(cè)TNF-α、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、ICAM-1以及p38的表達(dá)均顯著升高，而AQP-1則表達(dá)明顯降低、RT-PCR法檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致。抗生素及中藥處理組與模型組比較，上述細(xì)胞因子除AQP-1外的表達(dá)明顯降低，而AQPI表達(dá)上調(diào)，低于假手術(shù)組，抗生素及中藥處理組兩組檢測(cè)數(shù)據(jù)相近

13、。上述結(jié)果提示中藥組可能通過抑制某種核心細(xì)胞因子的表達(dá)，繼而抑制其他細(xì)胞因子的過度表達(dá)來減輕膿毒癥肺損傷。 3.實(shí)驗(yàn)三：與SHAM組比較，模型組應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法、RT-PCR法及western blot法檢測(cè)TNF-α、L-1、IL-6、ICAM-1的水平表達(dá)明顯升高。而中藥處理組及p38抑制劑組與模型組比較，上述細(xì)胞因子的表達(dá)則明顯降低，此兩組檢測(cè)數(shù)據(jù)相近。 結(jié)論:膿毒癥在創(chuàng)傷和感染等應(yīng)激狀態(tài)下，腸道的屏障功能受損

14、，腸道內(nèi)大量的細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)門靜脈及淋巴系統(tǒng)侵入血液循環(huán)，造成腸源性感染和毒性網(wǎng)絡(luò)，引起全身多器官功能衰竭，急性肺損傷（ALI）發(fā)生早、病情嚴(yán)重，常是病人死亡的直接原因。ALI是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其嚴(yán)重階段即是急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）； ARDS是多種原因引起的肺部失控性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，革蘭氏陰性桿菌內(nèi)毒素（LPS）介導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在ARDS的發(fā)病過程中起關(guān)鍵性作用。TNF-α是機(jī)體受到有

15、害刺激后最初分泌的細(xì)胞因子，它可誘導(dǎo)其它多種因子的產(chǎn)生，這些促炎癥細(xì)胞因子之間相互作用可形成許多正反饋環(huán)，導(dǎo)致所謂炎癥“級(jí)聯(lián)效應(yīng)”的發(fā)生，但其內(nèi)在相互關(guān)系及調(diào)控可能與某種核心細(xì)胞因子有關(guān)，它可聯(lián)系上下游的靶基因。 1.實(shí)驗(yàn)一證實(shí)膿毒癥大鼠肺損傷時(shí)幾種主要的炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)的情況，并從病理學(xué)角度充分證實(shí)。證實(shí)了炎性介質(zhì)的過度表達(dá)是造成膿毒癥肺損傷的重要原因。經(jīng)復(fù)方清下湯處理的動(dòng)物模型肺損傷得以減輕。 2.膿毒癥誘發(fā)AL

16、I的內(nèi)在機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)通過膿毒癥大鼠肺損傷模型的建立，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、RT-PCR以及western blot等手段，通過測(cè)定各組細(xì)胞因子灰度值，證實(shí)了膿毒血癥大鼠肺損傷時(shí)幾種主要的炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)和某些蛋白表達(dá)的情況，并從分子生物學(xué)水平證實(shí)炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1的過度表達(dá)和p38通路的活化是造成膿毒癥肺損傷的重要原因，而AQP-1的分泌表達(dá)則具有相反效果。經(jīng)復(fù)方清下湯處理的動(dòng)物模型肺損傷得以減

17、輕，提示我們是否可以通過抑制某種介導(dǎo)多細(xì)胞因子過度表達(dá)的某種信號(hào)通路，為治療膿毒血癥大鼠肺損傷提供一個(gè)可能的新的手段。 3.在實(shí)驗(yàn)一、二基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)三通過膿毒癥大鼠肺損傷模型的建立，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、RT-PCR以及western blot等手段，通過測(cè)定各組細(xì)胞因子灰度值，證實(shí)復(fù)方清下湯和p38抑制劑處理的動(dòng)物模型肺損傷得以減輕，炎性介質(zhì)TNF-α、IL-1、IL-6、ICAM-1的表達(dá)下調(diào)。提示膿毒癥大鼠肺損傷時(shí)處于上下游中