TLR2和TLR4活化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對人臍血CD34+細(xì)胞遷移能力的影響以及差異表達(dá)的MicroRNAs及其在TLR信號通路中的調(diào)控作用.pdf

1、背景和目的：Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫受體，在天然免疫及獲得性免疫過程中均發(fā)揮非常重要作用。研究表明，TLR同樣表達(dá)于多種非免疫細(xì)胞，并發(fā)揮一定生物學(xué)效應(yīng)。前期工作中我們已證實(shí)，人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）表達(dá) TLR2和TLR4，并參與MSC調(diào)控的造血支持功能。作為骨髓造血微環(huán)境的重要組成成分，MSC在造血干細(xì)胞的動(dòng)員和

2、歸巢中發(fā)揮重要作用。微小RNA（microRNAs）是通過介導(dǎo)mRNA降解或抑制靶基因的翻譯參與各種生物學(xué)功能。本研究利用TLR2激動(dòng)劑（PAM3CSK4）和TLR4激動(dòng)劑（LPS）體外活化人骨髓來源的MSC，首先觀察 TLR2和/或 TLR4活化的MSC分泌的上清對人臍血CD34+造血干祖細(xì)胞遷移能力的影響；其次鑒于Toll樣受體的活化在細(xì)胞增殖，分化，遷移和BM-MSC的造血支承功能方面的重要作用，進(jìn)一步對這些過程的分子機(jī)制進(jìn)行探討

3、，初步闡明TLRs是否調(diào)控人骨髓來源的MSC的微小RNA的表達(dá)量以及TLR2/4活化后差異表達(dá)的miRNAs在調(diào)控MSC在上述過程中的作用。
　　方法：應(yīng)用Ficoll法體外分離培養(yǎng)健康供者的骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC），流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面CD29、CD44、CD49e、CD90、CD105、CD166，CD14、CD34、CD31、CD45和HLA-DR以及健康供體骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)表

4、面 TLR2和TLR4的表達(dá)情況。TLR2激動(dòng)劑(PAM3CSK4)和TLR4激動(dòng)劑(LPS)預(yù)活化人骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞。MACS磁珠分選系統(tǒng)分離出新鮮臍血的CD34+造血干祖細(xì)胞，趨化實(shí)驗(yàn)測定MSCs培養(yǎng)上清對人臍血 CD34+細(xì)胞的趨化作用；了解TLR2或（和）TLR4的活化對BM-MSC誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞遷移活性的影響。ELISA法定量檢測培養(yǎng)上清中趨化因子SDF-1的分泌水平。上述收集的細(xì)胞

5、，應(yīng)用Trizol試劑提取出的各組總RNA，用于制備miRNA的測序文庫，該文庫隨后在Illumina Hiseq2000測序儀上測序，修剪讀取的數(shù)據(jù)（長度>=15nt）在miRBase19.0中進(jìn)行對比注釋，應(yīng)用在線靶基因預(yù)測軟件對差異表達(dá)的已知的miRNA的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測，為了進(jìn)一步了解靶基因的功能，對預(yù)測的靶基因進(jìn)行了基因本體論項(xiàng)目的分析，同時(shí)為了識別在代謝途徑或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中顯著富集的靶基因，進(jìn)而也進(jìn)行了 KEGG通路分析。

6、qRT-PCR隨機(jī)驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA。
　　結(jié)果：人骨髓MSC培養(yǎng)至第三代，流式細(xì)胞儀檢測顯示，骨髓MSC表面表達(dá)CD29、CD44、CD49e、CD90、CD105和CD166，不表達(dá)CD14、CD34、CD31、CD45和HLA-DR。符合MSC的形態(tài)和表型特征。人骨髓來源的MSC表面表達(dá)TLR2（31.5±4.6）％和TLR4（85.6±6.7）%。與未加培養(yǎng)上清的空白組相比，對照組、LPS和/或PAM3CSK4活化的

7、MSCs的培養(yǎng)上清對CD34+均有明顯趨化作用（p＜0.01）。進(jìn)一步研究顯示，與未加激動(dòng)劑的對照組（MSCs上清組）相比，LPS組、PAM3CSK4組、LPS和PAM3CSK4聯(lián)合刺激組的MSCs培養(yǎng)上清誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞的遷移作用均有顯著促進(jìn)作用（p＜0.05）。但LPS組、PAM3CSK4組、LPS和PAM3CSK4聯(lián)合刺激組的培養(yǎng)上清中，SDF-1濃度與對照組相比未見明顯變化（p＞0.05）。llumina Hiseq2000高

8、通量測序的結(jié)果顯示LPS和PAM3CSK4誘導(dǎo)的miRNAs表達(dá)發(fā)生了顯著地變化，與對照組相比，LPS組有67個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中35個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)，32個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)；PAM3CSK4組有97個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，其中46個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)，51個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)。GO分析表明，預(yù)測的靶基因富集到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞過程，調(diào)控大分子代謝過程等各個(gè)方面，KEGG途徑提示這些潛在的靶基因參與了許多重要的途徑，主要包括MAPK信號通路，P1

9、3-Akt信號通路，神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路和腫瘤的通路。qRT-PCR驗(yàn)證隨機(jī)的抽取的40個(gè)已知的差異表達(dá)的miRNA以及6個(gè)新的miRNA結(jié)果顯示與llumina Hiseq2000高通量測序的結(jié)果在上調(diào)和下調(diào)的步調(diào)上均保持一致。
　　結(jié)論: TLR2和/或 TLR4的活化可顯著增強(qiáng)骨髓MSCs誘導(dǎo)的人臍血CD34+細(xì)胞的遷移作用，但與趨化因子SDF-1無明顯關(guān)系，同時(shí)我們的研究明確了TLR2和TLR4活化的BM-MSC中miRN