羅非魚SDR超家族基因的生物信息學(xué)分析及其在性腺發(fā)育過(guò)程中的作用研究.pdf

1、短鏈脫氫還原酶（short-chain dehydrogenases/reductases。SDR）超家族包含了視黃醛脫氫酶、羥基類固醇脫氫酶、羰基還原酶、15羥基前列腺素脫氫酶、UDP-葡萄4-糖異構(gòu)酶以及GDP甘露糖4,6-脫水酶等。SDR家族成員表達(dá)于各種組織、器官，參與個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖等各個(gè)生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)隱馬爾可夫模型，在人類基因組中已經(jīng)鑒定了47個(gè)SDR亞家族，76個(gè)SDR基因。在植物中，如擬南芥、大豆、葡萄等植物中鑒定

2、了49個(gè)SDR亞家族，對(duì)應(yīng)著68-315個(gè)SDR基因，而在其他物種中還沒(méi)有進(jìn)一步的報(bào)道。同時(shí)關(guān)于SDR超家族在生殖過(guò)程中的功能研究?jī)H見(jiàn)于一些哺乳動(dòng)物中，而魚類中幾乎未見(jiàn)報(bào)道。為了系統(tǒng)深入的研究 SDR超家族成員在魚類性腺發(fā)育及性別決定與分化過(guò)程中的潛在作用，我們從基因組水平以及轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)尼羅羅非魚的SDR家族成員進(jìn)行了系統(tǒng)分析，并對(duì)其部分家族成員在性腺發(fā)育中的可能作用進(jìn)行了探討。
　　通過(guò)同源比對(duì)搜索以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，本研究從

3、尼羅羅非魚基因組中共分離到119個(gè)SDR超家族成員。除此之外，我們還從人類，雞，非洲爪蟾，斑馬魚，青鳉，腔棘魚，象鯊，斑點(diǎn)雀鱔，紅鰭東方鲀中分別分離了76、77、82、121、99、85、75、82、68個(gè)SDR基因。羅非魚中119個(gè)SDR基因可以分為49個(gè)亞家族，并且通過(guò)序列特征可以將SDR基因分為4類，“經(jīng)典”、“擴(kuò)展”、“復(fù)雜”和“未賦值”SDR，其中大多數(shù)SDR基因?qū)儆凇敖?jīng)典”SDR，其次為“擴(kuò)展”SDR。我們發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)SDR

4、基因在魚類進(jìn)行了多個(gè)旁系基因的復(fù)制，如rdh14。dhrs13。hsd17β12。tdh。rdh10和dhrs12這些基因存在3次復(fù)制基因；rdh12。cbr1。rdh8基因存在4個(gè)復(fù)制基因；hpgd基因存在5個(gè)復(fù)制。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)羅非魚SDR基因復(fù)制一般發(fā)生在同一條染色體，最為典型的是dhrs11基因，在羅非魚基因組中LG14上有12個(gè)串聯(lián)重復(fù)復(fù)制基因，通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化和共線性分析發(fā)現(xiàn)，dhrs11在羅非魚中進(jìn)行了多次串聯(lián)型復(fù)制。由于

5、魚類在進(jìn)化上經(jīng)歷了一次特有的基因組復(fù)制，由此我們推斷，SDR超家族在羅非魚中的擴(kuò)張可能是由某些家族成員的串聯(lián)型復(fù)制以及魚類特有的基因組復(fù)制造成的。
　　對(duì)尼羅羅非魚8個(gè)成魚組織的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明 bdh2。decr1。ndufa9。sccqdha。hsdl2。hsd17β10和qdpra基因?qū)儆诜罕磉_(dá)基因，即8個(gè)組織均有表達(dá)。dhrs7a。gale。blverb2高表達(dá)于頭腎;hsd3β2。hsd17β12b。rdh13,和kd

6、sr高表達(dá)于精巢；hsd3β7。hsd17β4。dhrs9a。rdh10b。rdh12a。dhrs7b。bdh1。decr2。hpgd1。spra。sdr39u高表達(dá)于卵巢,這些結(jié)果暗示上述基因在對(duì)應(yīng)組織的重要作用。通過(guò)對(duì)孵化后5天、30天、90天、180天尼羅羅非魚雌、雄性腺共8個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚119個(gè)SDR基因中有113個(gè)在性腺被檢測(cè)到。在5、30、90和180 dah性腺轉(zhuǎn)錄組中分別篩選到了25、3、47和

7、30個(gè)呈雌、雄性腺差異表達(dá)的SDR基因。用原位雜交（ISH）和real-time PCR驗(yàn)證了dhrs11-5、hsd11β2和hsd17β3的表達(dá)，結(jié)果表明，dhrs11-5在5天時(shí)表達(dá)量最高，呈現(xiàn)明顯的雌雄性腺差異性表達(dá)，在雌魚中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雄魚。hsd11β2在5天時(shí)就開(kāi)始在性腺中表達(dá)，6個(gè)月時(shí)表達(dá)量最高并且雄魚遠(yuǎn)高于雌魚，ISH結(jié)果表明hsd11β2表達(dá)于6個(gè)月精巢的間質(zhì)細(xì)胞；hsd17β3主要表達(dá)于頭腎，其結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)

8、果一致。
　　轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室早期研究都一致表明，hsd3β1在5天時(shí)表現(xiàn)出雌性特異表達(dá)，并且表達(dá)量逐漸升高，在30d左右達(dá)到最高；同時(shí)在XY雄魚性腺中hsd3β1的表達(dá)從30d開(kāi)始逐漸上升，到90d的時(shí)候開(kāi)始下降，直到180d還維持較高的表達(dá)水平。hsd3β7在XX雌魚性腺中的表達(dá)從孵化后60天才開(kāi)始急速上升，在雄魚中，hsd3β7的表達(dá)一直處于較低水平。并且 hsd3β基因是魚類性激素合成途徑的關(guān)鍵酶之一。通過(guò)CRISPR/

9、Cas9基因敲除技術(shù)對(duì)hsd3β1基因敲除后發(fā)現(xiàn)，對(duì)于雄魚，在4個(gè)月時(shí)，正常對(duì)照組中性腺存在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞等各級(jí)生精細(xì)胞，而在hsd3β1基因敲除陽(yáng)性魚的精巢中只能看見(jiàn)少數(shù)精原細(xì)胞，并且通過(guò)real-time PCR發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂相關(guān)基因顯著性下調(diào)，預(yù)示著hsd3β1的敲除導(dǎo)致了精子發(fā)生的延遲。Hsd3β1基因敲除后的雌魚的卵巢則部分性逆轉(zhuǎn)為精巢或者精卵巢，預(yù)示著hsd3β1可能通過(guò)性腺類固醇的生成參與羅非魚的性別決定和性腺

10、的生長(zhǎng)，同時(shí)也進(jìn)一步驗(yàn)證了SDR家族基因可能對(duì)于魚類性別決定發(fā)揮重要作用。
　　綜上所述，我們?cè)谀崃_羅非魚基因組中分離到119個(gè)SDR基因，cbr、dhrs11等基因在羅非魚的基因組中發(fā)生了串聯(lián)型復(fù)制。對(duì)尼羅羅非魚8個(gè)成魚組織的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，有113個(gè)SDR基因在性腺表達(dá)，用ISH和real-time PCR驗(yàn)證了dhrs11-5、hsd11β2和hsd17β3的表達(dá)，其結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組一致。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除h