登革病毒2型及其E蛋白與宿主細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的關(guān)系.pdf

1、登革病毒(denguevirus，DV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，分為四個(gè)血清型(DV1～4)。DV主要通過(guò)埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，每種血清型都可引起人類(lèi)登革熱(classicaldenguefever，DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(denguehemorrhagicfever/dengueshocksyndrome，DHF/DSS)。近年來(lái)，隨著旅游業(yè)的發(fā)展和地球溫暖化，DF和DHF/DSS流行、暴發(fā)越來(lái)越頻繁。DHF/D

2、SS患者病死率高，發(fā)病機(jī)制不清。 較多的臨床研究顯示肝細(xì)胞是DV的重要靶細(xì)胞之一，肝損害在DHF/DSS發(fā)病過(guò)程中占有重要地位： 1)肝組織中可以檢測(cè)到DV抗原，并能分離到具有感染性的病毒； 2)DV還可以感染體外培養(yǎng)的HepG2，HuH-7，HA22T，Hep3B，PLC等人類(lèi)肝癌細(xì)胞株，培養(yǎng)上清中也可檢測(cè)到成熟的病毒顆粒； 3)DHF/DSS病人常常出現(xiàn)肝腫大，尸檢可見(jiàn)肝組織脂肪變性，枯否氏細(xì)胞肥大等

3、。血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高，凝血酶含量下降，其幅度變化與肝損害程度及出血、休克的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DV可以直接感染肝細(xì)胞，引起肝臟損傷，換言之，肝臟可能是DV重要的靶器官之一。然而，在過(guò)去相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間里，學(xué)者們對(duì)DV感染后凝血系統(tǒng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥因子變化做了較多的研究，與之相比，肝細(xì)胞損傷機(jī)制所受關(guān)注較少，如能發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制對(duì)肝細(xì)胞哪些方面產(chǎn)生了影響，找到宿主細(xì)胞參與病毒復(fù)制的關(guān)鍵分子，不僅對(duì)DV感染機(jī)制的闡明有重要意義，同時(shí)也為進(jìn)

4、一步研究抗病毒藥物奠定重要的基礎(chǔ)。 本研究主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1.DV2感染對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)外GSH水平的影響 感染組加入DV2以MOI=10感染HepG2細(xì)胞，模擬感染組則加入56℃滅活30min的病毒液，同等條件置于37℃，以感染起始記為O時(shí)，在感染10min、20min、30min、40min、60min/1h、2h、6h、12h、24h、48h(后5個(gè)時(shí)相點(diǎn)吸附后1h，更換病毒維持液)時(shí)，分別用PBS

5、充分洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化，取出細(xì)胞。經(jīng)過(guò)四次快速凍融，離心取上清用于GSH的測(cè)定。取相同數(shù)量的細(xì)胞經(jīng)超聲裂解用于測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒感染后10min、20min、30min、40min、60min/1h，HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平與模擬感染組比較，呈下降趨勢(shì)，其中以30min下降最為明顯，為16.82±0.86nmol/mg(n=5)，與模擬感染組23.14±1.41nmol/mg(n=5)和感染組的其他時(shí)相點(diǎn)比較均有顯著

6、差異(P＜0.01)。病毒感染后2h、6h、12h、24h、48h，HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平與模擬感染組比較，仍呈下降趨勢(shì)，其中以2h，24h時(shí)下降較為明顯，分別為29.51±3.16nmol/mg(n=5)和17.75±3.32nmol/mg(n=5)，與相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)的模擬感染組35.45±3.55nmol/mg(n=5)和22.91±4.15nmol/mg(n=5)以及感染組的其它時(shí)相點(diǎn)比較，差異顯著(P＜0.05)，其后逐漸恢復(fù)，

7、到48h時(shí)已與模擬感染組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 感染后30min上清中的GSH含量為47.86±3.00nmol/ml(n=4)，較模擬感染組升高33.09％，且有顯著差異(P＜0.05)，而模擬感染組與病毒原液則無(wú)顯著差異(P＞0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明DV2感染能夠使HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降，改變宿主細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，且呈現(xiàn)階段性變化，推測(cè)可能與病毒的復(fù)制過(guò)程有關(guān)。結(jié)合感染后同一時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞外GSH水平的升高和文獻(xiàn)

8、報(bào)道，推測(cè)DV2感染后30min細(xì)胞內(nèi)GSH水平的快速降低可能是由于DV2感染所致細(xì)胞膜通透性增加、GSH的外漏引起的。 2.DV2E蛋白對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)外GSH水平的影響 首先構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)E蛋白的HepG2細(xì)胞株pRe-E/HepG2，并且通過(guò)PCR、酶切、核苷酸測(cè)序及間接免疫熒光法進(jìn)行了鑒定和檢測(cè)，確認(rèn)了該細(xì)胞中E蛋白的表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞株pRe-E/HepG2作為對(duì)照。 然后測(cè)定了pRe-E

9、/HepG2細(xì)胞內(nèi)外GSH的水平。結(jié)果：pRe-E/HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH水平與pRe/HepG2細(xì)胞對(duì)照組比較，呈下降趨勢(shì)。pRe-E/HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH平均濃度為25.61±2.23nmol/mg(n=4)，pRe/HepG2細(xì)胞內(nèi)的GSH平均濃度為33.38±1.07nmol/mg(n=4)，與pRe/HepG2細(xì)胞比較，pRe.E/HepG2細(xì)胞內(nèi)GSH下降了24.3％(P＜0.01)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期pRe-E/HepG2和p

10、Re/HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)上清0.5ml測(cè)定GSH濃度，發(fā)現(xiàn)pRe-E/HepG2細(xì)胞上清中GSH含量平均值為36.72±1.40nmol/ml(n4)，pRe/HepG2細(xì)胞上清中GSH含量平均為57.41±2.00nmol/ml(n=4)，前者相較后者明顯降低，兩者差異顯著(P＜0.05)，前者較后者平均下降了36.35％。以上結(jié)果表明，穩(wěn)定表達(dá)E蛋白的pRe-E/HepG2細(xì)胞較穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的pRe/HepG2細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)外GS

11、H濃度均下降顯著，提示E蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)不僅可以改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，還可以使宿主細(xì)胞外的GSH水平降低，在DV2感染誘使的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)變化的過(guò)程中，E蛋白可能起重要作用。 3.BSO及外源性GSH處理對(duì)DV2感染的影響 依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果并參照文獻(xiàn)，選擇BSO的處理濃度為0.2mM和1mM，外源性GSH的處理濃度為10mM和20mM。 在不感染病毒的情況下，培養(yǎng)上清中加入0.2mM、1mMBSO處

12、理18h，可使細(xì)胞內(nèi)GSH含量由空白對(duì)照組的24.53±2.59nmol/mg(n=5)分別下降至14.29±1.48nmol/mg(n=5)、14.05±1.93nmol/mg(n=5)(P＜0.05)，且兩種濃度下降幅度無(wú)顯著差異(P＞0.05)，幅度平均為42.24％(n=5)。在DV2感染+BSO處理組，感染前18h分別用0.2mM、1mMBSO預(yù)處理HepG2細(xì)胞，然后用DV2以MoI=1感染HepG2細(xì)胞，并維持BSO濃度至

13、感染24h，空白對(duì)照組不加藥物處理。感染后24h收取病毒上清，噬斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度(PFU/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2mM與1mMBSO處理組病毒滴度較空白對(duì)照組分別上升了119.79％(n=5)和127.51％(n=5)，與空白對(duì)照組比較差別顯著(P＜0.05)，但兩種濃度BSO處理組的病毒滴度上升幅度無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 在不感染病毒的情況下，培養(yǎng)上清中加入10mM、20mMGSH溶液與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)GSH含量均

14、無(wú)顯著差異(P＞0.05)；在DV2感染+GSH處理組，從感染起始到感染24h維持上清內(nèi)GSH濃度分別為10mM、20mM，空白對(duì)照組不加藥物處理。感染后24h收取病毒上清，測(cè)定病毒滴度(PFU/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)較空白對(duì)照組而言，10mM與20mMGSH處理組病毒滴度分別下降40.24％(n=5)和56.62％(n=5)，兩種濃度GSH處理組均與空白對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)，且20mMGSH處理組病毒滴度下降更為明顯(P＜0.05