流感NA（H3N2）基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及序列進(jìn)化分析.pdf

1、研究目的： 從2002年H3N2流感獲得NA基因，構(gòu)建入pCI—neo載體，制備DNA疫苗，對進(jìn)行序列分析，探討其分子進(jìn)化關(guān)系，為研究流感DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 從2002年流行流感患者分離甲型流感病毒，鑒定病毒分離株，病毒經(jīng)9~11齡的雞胚和MDCK細(xì)胞培養(yǎng)增殖，-70℃保存提取流感病毒RNA，設(shè)計引物進(jìn)行NA基因RT-PCR，將特異性PCR產(chǎn)物克隆到T—vector，進(jìn)行序列測定和分析。并將基因亞克

2、隆到真核表達(dá)載體pCI—neo，利用生物信息學(xué)技術(shù)對H3N2型流感病毒的NA基因進(jìn)行了同源性比較和進(jìn)化分析。 研究結(jié)果： 鑒定病毒分離株為A/Guangdong/236/2002/H3N2，A/Guangdong/068/2002/H3N2，A/Guangdong/448/2002/H3N2，A/Guangdong/027/2002/H3N2.獲得一個核苷酸長度為1410bp的基因編碼469個氨基酸H3N2病毒NA基因，

3、構(gòu)建了真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。1968—1975年毒株與2000年后毒株變異較大，2000年之后毒株變異較小。NA基因776位點，本課題研究毒株2002廣東株發(fā)生了獨特的變異，由A→G。在1185位點，本課題研究毒株2002廣東株和1998年廣東株發(fā)生了獨特的變異(A→G)，有地域特征。2000年以后毒株發(fā)生穩(wěn)定變異的氨基酸位點有18，23，30，42，93，127，143，208，216，249，265，267，307，33

4、9，344，346，369，385，437。2004年以來的毒株199位由E突變回1988年以前毒株K，432位由Q突變回1984年以前毒株E。385位1992年以前毒抹為T，之后到2001年毒株突變?yōu)镵，2002年以來毒株為N，對于毒株適應(yīng)選擇壓力有重要意義。 結(jié)論： 1.由H3N2流感病毒株中得到了NA基因編碼區(qū)cDNA序列，序列分析正確，成功構(gòu)建了其真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其免疫功能奠定了基礎(chǔ)。 2.19