轉(zhuǎn)錄因子誘餌策略中由載體表達(dá)的雙鏈寡核苷酸的功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子誘餌策略（TFDstrategy，TranscriptionFactorDecoystrategy）是近年來研究和應(yīng)用較廣的一種用來探索轉(zhuǎn)錄因子功能的策略。利用人工合成的含有某轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列的小片段脫氧寡核苷酸雙鏈能與該轉(zhuǎn)錄因子正常的結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的特性，達(dá)到封閉該轉(zhuǎn)錄因子活性的目的。近年來已有眾多利用TFD策略研究轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道，如NFκB、Sp1、NFAT等等。轉(zhuǎn)錄因子誘餌策略以其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子封閉效果切實(shí)、功能

2、分子為小分子等優(yōu)點(diǎn)被越來越廣泛地應(yīng)用到分子生物學(xué)領(lǐng)域，并于近期初步用于臨床，取得了較好效果。
　　雖然轉(zhuǎn)錄因子誘餌策略有眾多優(yōu)點(diǎn)，但其缺陷同樣突出，其中以功能分子脫氧寡核苷酸ODN（oligodeoxynucleotide）的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移效率過低最為明顯。TFD策略發(fā)揮作用需要ODN進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，但未經(jīng)修飾的ODN入核后有大約90％的分子被溶酶體攝取降解，僅有10％左右的ODN能進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。這對(duì)TFD策略的實(shí)際

3、應(yīng)用產(chǎn)生很大的影響。目前有數(shù)種方案用以解決這項(xiàng)難題，如引入核定位信號(hào)肽（NLS）交聯(lián)ODN以提高核轉(zhuǎn)移效率、對(duì)ODN進(jìn)行修飾以提高其對(duì)溶酶體降解的抵抗力以及利用新型轉(zhuǎn)染試劑提高小分子（ODN）的轉(zhuǎn)染效率等。但這些方案或者成本過高，或者工藝復(fù)雜，未能被廣泛應(yīng)用。因此尚需探索新的、更方便經(jīng)濟(jì)的方法。
　　我們?cè)趯?duì)莖-環(huán)小干擾RNA即shRNA的研究中發(fā)現(xiàn)，其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)過程會(huì)出現(xiàn)一個(gè)階段，表達(dá)出的單鏈RNA分子會(huì)形成暫時(shí)性的局部雙鏈。

4、我們?cè)O(shè)想，既然含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列的ODN(系雙鏈DNA)具有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子封閉功能，那么與某轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列相似的雙鏈RNA是否也具有類似的封閉效應(yīng)呢？如果猜想是正確的話，那我們就可以利用shRNA來表達(dá)這種雙鏈RNA，將載體包裝病毒，這樣既可以達(dá)到封閉的目的，又極大地提高了功能分子的核轉(zhuǎn)移效率。因此本課題將對(duì)此進(jìn)行探討。
　　【目的】
　　1.明確能夠表達(dá)與某轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列相似的雙鏈RNA的載體是否能夠封閉

5、該轉(zhuǎn)錄因子的活性；2.探索這種載體發(fā)揮封閉功能的機(jī)制
　　【方法】
　　1.選擇在HEK293細(xì)胞中有表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子NFκB，構(gòu)建其相關(guān)載體，包括目的載體即表達(dá)上述雙鏈RNA的載體（vector-basedON,V-BON）及其錯(cuò)序?qū)φ誷crambledV-BON，同時(shí)構(gòu)建NFκB的shRNA作為陽(yáng)性對(duì)照1，合成未經(jīng)修飾的NFκB結(jié)合位點(diǎn)序列ODN作為陽(yáng)性對(duì)照2及其錯(cuò)序?qū)φ誷crambledODN；2.將各種載體或小分子分別

6、轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞受藥物作用后的凋亡情況；實(shí)時(shí)定量PCR及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)NFκB下游基因IL-8及MCP-1轉(zhuǎn)錄活性變化；3.隨機(jī)選擇在HEK293細(xì)胞中有表達(dá)的3種轉(zhuǎn)錄因子（FOS、AP-2α及RXRA）,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)這三種轉(zhuǎn)錄因子下游基因轉(zhuǎn)錄活性的變化以明確這種封閉效應(yīng)是否廣泛存在；4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)NFκB、FOS、

7、AP-2α及RXRA各轉(zhuǎn)錄因子本身轉(zhuǎn)錄活性的變化，以明確封閉效應(yīng)是否系載體的RNAi作用所致，探索載體V-BON發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1.目的載體V-BON能夠抑制HEK293細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡
　　我們?cè)诔晒?gòu)建各種載體的基礎(chǔ)上，將各載體及小分子ODN分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，分別在24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)做MTT試驗(yàn)。結(jié)果證明，三個(gè)時(shí)段均出現(xiàn)相似的趨勢(shì)，即V-BON與shRNA對(duì)細(xì)胞生

8、長(zhǎng)的相對(duì)抑制率相似（V-BON：42.3±0.152％、57.2±0.612％、29.1±0.441％；shRNA：54.2±0.231％、64.3±0.246％、31.6±0.225％），而合成的小片段ODN對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的相對(duì)抑制率則較低（ODN：18.2±0.294％、21.1±0.546％、11.6±0.331％）。
　　按MTT試驗(yàn)得出的結(jié)論，選擇48小時(shí)作為以下其他實(shí)驗(yàn)的處理時(shí)間。各載體及小片段轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，向各組加

9、依托伯苷（VP-16）至終濃度50umol/L。藥物處理24小時(shí)后收集細(xì)胞做流式細(xì)胞術(shù)。結(jié)果顯示，V-BON與shRNA對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡的促進(jìn)程度即相對(duì)抑制率相似（V-BON：42.2±0.437％vsshRNA：50.2±0.512％），而小片段ODN促進(jìn)程度則較低（22.3±0.601％）。以上相對(duì)抑制率為各載體或分子對(duì)各自陰性對(duì)照的相對(duì)抑制率（V-BONvsscrambledV-BON；shRNAvs空白載體；ODNvsscram

10、bledODN）。
　　MTT試驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)均證明V-BON能夠抑制HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡，效果與shRNA相似。
　　2.V-BON能夠影響轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)NFκB、FOS、AP-2α及RXRA各因子下游基因轉(zhuǎn)錄
　　成功構(gòu)建了NFκB下游基因IL-8及MCP-1的熒光素酶報(bào)告基因載體。報(bào)告基因分析證明，轉(zhuǎn)染V-BON后細(xì)胞內(nèi)IL-8及MCP-1的轉(zhuǎn)錄活性明顯較陰性對(duì)照組降低。
　　成功構(gòu)建FOS、AP

11、-2α及RXRA等因子的相關(guān)載體（V-BON、scrambledV-BON及shRNA）。將NFκB、FOS、AP-2α及RXRA等因子的各載體或小分子分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄并做實(shí)時(shí)定量PCR（SYBRGreen）。結(jié)果顯示，各因子下游基因mRNA表達(dá)出現(xiàn)程度不一的抑制（轉(zhuǎn)錄因子抑制其表達(dá)者則是活性升高）。V-BON與shRNA的抑制率相似，而小片段ODN效果較差。
　　3.V-BON并不會(huì)影響其相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞

12、內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性，說明V-BON至少并非通過對(duì)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的RNA干擾來發(fā)揮作用
　　NFκB、FOS、AP-2α及RXRA等因子的各載體或小分子分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取RNA,反轉(zhuǎn)錄并做實(shí)時(shí)定量PCR,檢測(cè)四種轉(zhuǎn)錄因子本身轉(zhuǎn)錄活性的變化。結(jié)果顯示，與錯(cuò)序?qū)φ障啾龋琕-BON未表現(xiàn)出明顯的抑制效果，而shRNA對(duì)各分子活性的抑制則很明顯。小片段ODN對(duì)各分子活性亦無明顯影響。
　　【結(jié)論】
　　本研究首次提出能夠表達(dá)與某轉(zhuǎn)錄因子