NF-κB的反義寡核苷酸對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的影響.pdf

1、目的:
　　 1、設(shè)計(jì)小鼠NF-κB的反義寡核苷酸，探討其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6等炎癥因子的影響。
　　 2、研究LPS及Ti顆粒對(duì)炎癥因子分泌的影響。
　　 方法:設(shè)計(jì)并合成小鼠NF-κB的反義寡核苷酸鏈（含19個(gè)堿基）及對(duì)應(yīng)的正義寡核苷酸鏈。體外培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，實(shí)驗(yàn)分為六組，每組六孔。分別為巨噬細(xì)胞組(Con組)、巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)體組(lipofecter組)、巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)體

2、+正義寡核苷酸組（Sense組）、巨噬細(xì)胞+脂質(zhì)體+反義寡核苷酸組（Antisense組）、巨噬細(xì)胞+內(nèi)毒素（LPS組）、巨噬細(xì)胞+鈦顆粒組（Ti 組）。Antisense組、Sense組利用脂質(zhì)體分別將NF-κB的反義寡核苷酸鏈和正義寡核苷酸鏈導(dǎo)入巨噬細(xì)胞；lipofecter組、LPS組與Ti 組分別使用脂質(zhì)體、內(nèi)毒素、鈦顆粒作為不同的干預(yù)因素，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；Con組不加刺激因素，然后的操作與實(shí)驗(yàn)組相同。在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別取

3、培養(yǎng)3h、24h、48h時(shí)各組上清液50μl，ELISA法分別測(cè)定上清液的NF-κB和TNF-α、IL-6的含量。48h時(shí)收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA。M-MLV一步法行RT-PCR，逆轉(zhuǎn)錄TNF-α和IL-6 mRNA。產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)成像，測(cè)量吸光度值，計(jì)算mRNA表達(dá)水平相對(duì)值。
　　 結(jié)果:
　　 1、在培養(yǎng)3h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組NF-κB、TNF-α、IL-6數(shù)值與Con組比較

4、差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、在培養(yǎng)24h時(shí)，Antisense組NF-κB、TNF-α、IL-6數(shù)值與Con組數(shù)值明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LPS組、Ti組較Con組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。lipofecter組、Sense組數(shù)值與Con組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、在培養(yǎng)48h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)值與對(duì)照組比較和24h時(shí)的數(shù)值有相同的變化趨勢(shì)。RT-PCR法測(cè)mRNA (TNF-α、IL-6)表達(dá)水平相對(duì)值：A

5、ntisense組目的條帶較Con組灰度值明顯減弱，LPS組、Ti組目的條帶較Con組灰度值明顯增加，lipofecter組、Sense組目的條帶灰度值與Con組相似。
　　 結(jié)論:
　　 1、設(shè)計(jì)并合成的NF-κB的反義寡核苷酸成功地轉(zhuǎn)染進(jìn)了巨噬細(xì)胞。
　　 2、NF-κB的反義寡核苷酸成功抑制了NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而抑制了TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)。LPS、Ti都能明顯刺激巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子。NF