熊去氧膽酸通過調(diào)節(jié)Bax信號途徑抑制肝細胞凋亡.pdf

1、研究背景和目的:
　　 研究表明，在各種急慢性肝病中，凋亡是肝細胞損害的基本特征，它可能是不同類型肝病肝細胞死亡的最終通路，如酒精性肝病、病毒性、自身免疫性肝炎、膽汁淤積性肝病、肝臟代謝性疾病等。通過藥物抑制肝細胞的凋亡，減輕肝細胞的損傷，保護肝細胞是治療肝病的一個重要的研究方向。
　　 膽汁淤積性肝病是由于肝細胞分泌受損使肝毒性膽汁酸在肝細胞內(nèi)增多引起的。盡管在膽汁於積時肝細胞受損的機制是多因素的，但疏水性膽汁酸誘導(dǎo)的

2、凋亡可能是一個主要的作用。在體內(nèi)外實驗中，疏水性的膽汁酸被證實可以誘導(dǎo)肝細胞的凋亡。比如，給予50μmol/L脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)8h后，原始的大鼠肝細胞的凋亡率可達20％。
　　 腫瘤抑制蛋白p53是一個轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)有關(guān)細胞周期停滯和細胞凋亡基因的表達。最近研究表明，p53可能是通過轉(zhuǎn)錄依賴和轉(zhuǎn)錄不依賴的機制誘導(dǎo)細胞凋亡。普遍認為p53發(fā)動凋亡是通過作為序列特異性的轉(zhuǎn)錄激活因子活化了前凋亡基因

3、，如Bax、Noxa和PUMA等。這些蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體，從而降低線粒體膜電位和促進細胞色素c的釋放，進而活化了Apaf—1/Caspase—9的凋亡級聯(lián)反應(yīng)。
　　 熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是一親水性二羥膽酸，具有利膽、細胞保護、拮抗疏水性膽汁酸的細胞毒性、抗凋亡、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用。大量的臨床研究表明UDCA對多種膽汁淤積性肝病如原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎和肝內(nèi)膽汁淤積癥

4、等具有顯著的療效。體內(nèi)外實驗證明，UDCA保護肝細胞損傷主要是通過抗凋亡作用，而其確切機制還不是很清楚。本研究以大鼠骨髓基質(zhì)干細胞誘導(dǎo)定向分化21天后的肝細胞為模型探討UDCA在肝細胞凋亡過程中的作用及其作用機制。
　　 研究方法:
　　 從大鼠股骨骨髓中分離骨髓基質(zhì)干細胞，在體外誘導(dǎo)分化為成熟的肝細胞。用PBS(作為對照組)，100μmol/L DCA，100μmol/L DCA+100μ mol/L UDCA及100

5、μmol/L UDCA分別處理肝細胞。用Hoechst33258染核和測定Caspase3的活性來評估肝細胞的凋亡程度；用RT—PCR和Realtime PCR檢測凋亡過程中p53及BaxmRNA的表達：用免疫組化的方法檢測凋亡過程中Bax蛋白的表達。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.DCA可以誘導(dǎo)肝細胞凋亡
　　 用Hocchst33258染核對細胞的凋亡進行評估，相對于對照組，肝細胞在DCA作用8h和18h后出現(xiàn)

6、了明顯的凋亡(p＜0.05)。同樣，Caspase3活性在DCA的作用8h和18h后也明顯增高(p＜0.05)?？梢?，DCA可以誘導(dǎo)肝細胞的凋亡。
　　 2.UDCA可以抑制DCA誘導(dǎo)的肝細胞凋亡
　　 用Hoechst33258染核對細胞的凋亡進行評估，UDCA的給予則可以明顯抑制DCA誘導(dǎo)的肝細胞凋亡(p＜0.05)。而UDCA的同時給予則可以明顯的抑制DCA誘導(dǎo)Caspase3活性的升高(p＜0.05)。可見，UD

7、CA可以抑制DCA誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。
　　 3.UDCA可以抑制DCA誘導(dǎo)的肝細胞凋亡過程中p53及Bax mRNA和Bax蛋白的表達
　　 用Realtime PCR方法分析各個實驗組在作用8h和18h后，p53及Bax的mRNA的表達情況?？梢园l(fā)現(xiàn)，在加DCA后，無論是8h還是18h，相對于對照組，肝細胞的p53及BaxmRNA表達都明顯增加(p＜0.05)；而同時加入UDCA可以發(fā)現(xiàn)p53及Bax的表達明顯減少(p

8、＜0.05)。同時還用RT-PCR的方法檢測了Bax mRNA的表達，其結(jié)果和Realtime PCR的是一致的。用免疫組化方法檢測各個實驗組在作用8h和18h后Bax蛋白的表達。相對于對照組，DCA作用組的Bax蛋白的表達明顯增加(p＜0.05)；而同時加入UDCA可以發(fā)現(xiàn)Bax蛋白的表達明顯減少(p＜0.05)。由此可見，DCA可能是通過活化p53/Bax信號途徑誘導(dǎo)肝細胞的凋亡，而UDCA可能是通過抑制p53/Bax信號通路而阻止