光滑假絲酵母菌耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 確定38株光滑假絲酵母菌臨床分離株中唑類耐藥株的耐藥機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.采用NCCLS2002年公布的M27-A2方案的微量稀釋法測(cè)定5種常用抗真菌藥物（兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑）對(duì)38株光滑假絲酵母菌的MIC值。
　　 2.采用MLST技術(shù)及REP-PCR技術(shù)用于光滑假絲酵母菌基因分型，MLST是擴(kuò)增光滑假絲酵母菌6個(gè)管家基因內(nèi)片段，擴(kuò)增片段測(cè)序后與

2、數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)比對(duì)得出每個(gè)基因的等位基因號(hào)，再根據(jù)6個(gè)等位基因號(hào)的組合得出每株菌的等位基因譜，即序列型，REP-PCR是擴(kuò)增真菌基因組中的重復(fù)序列，通過(guò)電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異，是一種基因組指紋分析方法。
　　 3.采用real time RT-PCR方法檢測(cè)CDR1，CDR2及SNQ2等外排泵基因在38株光滑假絲酵母菌的表達(dá)，采用羅丹明6G外排分析考察細(xì)胞膜外排泵功能，待測(cè)菌株在PBS中震蕩培養(yǎng)2小時(shí)以耗竭葡萄糖，攝入

3、羅丹明6G后，菌液分為兩管，一管加入PBS，一管加入含葡萄糖PBS，15分鐘后FACS分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。
　　 4.采用real time RT-PCR方法檢測(cè)ERG11基因在38株光滑假絲酵母菌的表達(dá)，PCR擴(kuò)增ERG11基因全長(zhǎng)并測(cè)序。
　　 5.PCR擴(kuò)增PDR1基因的兩段，一段為中心調(diào)節(jié)區(qū)域，另一段為C-端激活區(qū)域，并測(cè)序，對(duì)于發(fā)現(xiàn)有PDR1基因突變的菌株，高保真酶擴(kuò)增其PDR1基因全長(zhǎng)，并克隆到高表達(dá)質(zhì)粒載體p

4、YES2/CT中，將pYES2/CT-PDR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ATCC2001 ura3突變株(ATCC2001’)，觀察轉(zhuǎn)化成功的受體菌的紙片法藥敏結(jié)果，real time RT-PCR檢測(cè)其CDR1，CDR2，ERG11及SNQ2基因的表達(dá)，采用羅丹明6G外排分析考察其細(xì)胞膜外排泵功能，以證實(shí)PDR1基因突變與耐藥的關(guān)系;real time RT-PCR方法檢測(cè)PDR1基因在38株光滑假絲酵母菌的表達(dá)。
　　 6.ATP檢測(cè)試劑盒檢

5、測(cè)菌株ATP量，Pierce BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)菌株蛋白含量，羅丹明123染色后FACS分析細(xì)胞線粒體膜電位，DCFH-DA染色后FACS檢測(cè)菌株活性氧(ROS)的含量，線粒體透射電鏡觀察菌株線粒體數(shù)量及嵴的結(jié)構(gòu)，觀察YEPG平板上菌落生長(zhǎng)情況，將5個(gè)濃度梯度的菌液點(diǎn)種至含不同呼吸抑制劑的GLC固體培養(yǎng)基上，觀察菌株在含不同呼吸抑制劑的GLC固體培養(yǎng)基上藥敏紙片的抑菌圈大小，觀察菌株在有氧與無(wú)氧生長(zhǎng)條件下藥敏紙片的抑菌圈大小，觀察

6、呼吸抑制劑對(duì)膜電位和活性氧ROS的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.38株光滑假絲酵母菌中氟康唑耐藥17株，伊曲康唑耐藥12株，伏立康唑耐藥7株。其中，7株伏立康唑耐藥株同時(shí)對(duì)伊曲康唑、伏立康唑耐藥，12株伊曲康唑耐藥株均對(duì)氟康唑耐藥，38株光滑假絲酵母菌對(duì)兩性霉素B、5-氟胞嘧啶均敏感。
　　 2.38株菌的REP-PCR和MLST兩種分型方法的結(jié)果完全相同，REP-PCR的A，B，C，D，E型別分別對(duì)應(yīng)于MLS

7、T的ST7，ST3，ST19，ST45和新型，38株菌中A型29株(76.3％)，B型5株(13.2％)，C型2株(5.3％)，D型、E型各1株(2.6％)，同一患者不同時(shí)期分離菌株的基因型相同。
　　 3.耐藥株與敏感株CDR1基因表達(dá)量差異有顯著性(P=0.001)，耐藥株與敏感株CDR2基因表達(dá)量差異無(wú)顯著性(P=0.946)，但患者4分離到的3株耐藥株4b，4c及4d其CDR2基因表達(dá)量分別為敏感株4a的2.75、4.1

8、4及3.7倍，耐藥株與敏感株ERG11、SNQ2基因表達(dá)量差異無(wú)顯著性(P=0.850)。耐藥菌對(duì)羅丹明6G外排能力顯著強(qiáng)于敏感菌(P=0.001)。
　　 4.38株光滑假絲酵母菌ERG11未發(fā)現(xiàn)突變，耐藥株與敏感株ERG11基因表達(dá)水平差異無(wú)顯著性(P=0.283)。
　　 5.17株氟康唑耐藥株P(guān)DR1基因均分別發(fā)現(xiàn)一處有義突變，4d菌株P(guān)DR1基因連接載體轉(zhuǎn)化ATCC2001’后，藥敏紙片法顯示對(duì)氟康唑耐藥，CD

9、R1基因表達(dá)量為ATCC2001’的20.53倍，CDR2基因表達(dá)量為ATCC2001’的4.03倍，羅丹明6G外排試驗(yàn)結(jié)果顯示pYES2/CT-PDR1-ATCC2001’外排功能(熒光強(qiáng)度0.62)顯著強(qiáng)于ATCC2001’(熒光強(qiáng)度4.25)，并提示pYES2/CT-PDR1-ATCC2001’呼吸代謝速度低于ATCC2001’。2株耐藥株（11號(hào)、12號(hào)）及1株敏感株（17號(hào)）PDR1基因發(fā)生同義突變。耐藥株P(guān)DR1基因表達(dá)量高

10、于敏感株(P=0.012)。
　　 6.敏感菌株每mg蛋白產(chǎn)生ATP量顯著高于耐藥菌株(P=0.001)，敏感菌株膜電位(P=0.001)及細(xì)胞內(nèi)ROS量顯著高于耐藥菌株(P=0.000)，加入呼吸抑制劑NaN3后敏感菌株膜電位顯著下降(P=0.000)，耐藥菌株膜電位無(wú)變化或輕度下降。同一菌株厭氧條件下較有氧條件下更耐藥。加入經(jīng)典呼吸途徑抑制劑NaN3，菌株生長(zhǎng)更好，對(duì)藥物敏感性降低，加入交替呼吸途徑抑制劑SHAM后，菌株生長(zhǎng)

11、不良，對(duì)藥物敏感性升高。電鏡結(jié)果顯示僅耐藥的小菌落菌株可見線粒體異常，而耐藥的正常大小菌落線粒體未見明顯異常。由此可見，耐藥菌株的呼吸代謝異常并非均由線粒體缺陷引起。
　　 結(jié)論：
　　 17株耐唑類藥物光滑假絲酵母菌臨床分離株的耐藥機(jī)制與CDR1，CDR2等外排泵基因高表達(dá)(主要為CDR1)、外排泵功能強(qiáng)、PDR1基因突變、PDR1基因高表達(dá)、呼吸代謝異常等多因素有關(guān)。交替呼吸介導(dǎo)光滑假絲酵母菌耐藥，但耐藥菌株的呼吸代